蛍光リン光分光光度計 FluoroMax-4P

蛍光測定モード（キセノンランプ設定）からリン光測定モード（キセノンフラッシュランプ設定）にソフトウェア上で簡単に切換えができます。
これによりさらに測定の幅が広がります。

FluoroMax-4とFluoroMax-4Pの機能比較

測定原理

リン光の測定手順

5つの測定タイプから選択できます。

リン光スペクトルの求め方

蛍光測定のパラメータであるIntegation timeがなくなり、リン光測定ではSample Window、Delay After Flash、Time per Flash、Number of Flashesのパラメータの設定を行います。

このグラフはEuCl₃のリン光スペクトル測定のための典型的な設定条件を示したものです。

リン光減衰曲線の求め方

減衰シグナルSは曲線を示し、減衰シグナルの対数In（S）は減衰時間に対して直線を示すことから、一成分寿命の減衰であることがわかります。

EuCl₃のリン光寿命を減衰カーブのgradient（勾配）-8.834のマイナス逆数より計算すると113μsとなります。

アプリケーション例

ペプチド（peptide）+ リン光プローブ Tbの混合液の発光スペクトル

励起波長285nm
遅延時間　0μsの場合（赤実線）
遅延時間 50μsの場合（青点線）
スリット幅　励起側/発光側ともに2nm（Bandpass)
363nm付近のペプチドの蛍光が消えて、486nmおよび540nmのTbのリン光だけが観察されます。

リン光の減衰カーブ

(a）ペプチド（peptide）+ リン光プローブ Tb混合液のみ
   （リン光寿命τ = 3.8ms）
(b）蛍光プローブ Fluoresceinを添加したPeptide+Tb 混合液（リン光寿命τ = 3.0ms）
積算時間0.45nm スリット幅 励起側/発光側ともに5nm（Bandpass）
励起波長280nm 発光波長 540nmで検出
Fluoresceinを混合液に加えることで、より早いリン光減衰が起こることから、ドナー Peptide+Tb からアクセプター Fluorescein へのエネルギー転移がおこっていることを確認できます。
リン光測定をおこなうことで、物質の物理的および化学的な特性を調べることができます。

3-Dプロット

Delay After Flashによるリン光減衰カーブを使って、3-Dグラフを作成できます。異なる時間遅延による連続的スキャンを示しています。

リン光寿命の違いを利用した混合物成分の分離

寿命の違いに基づき異なるリン光成分を分離したいときにはDelay After Flashのパラメータを変えることで対応できます。グラフはテルビウム（Tb）とユーロピウム（Eu）の混合物を示しています。

アプリケーション

時間分解（Time-Gating）測定によるランタニドの発光スペクトルの分離

概論

分光学者らにとって、ランタニド（Ln）イオン特有のルミネセンス（luminescence）を検出することは長年の挑戦であった。 ルミネセンス測定において極めて低い吸収係数と発光量子効率を克服するために以下のような手段が用いられてきた。

1. X−H基（X＝O, N,・・・）由来の振動クエンチング効果を弱めるため、保護リガンドを利用
2. 同様にX−H基による振動クエンチング効果を弱めるため、重水素で置換された溶剤を利用
3. 吸収係数の高い集光型発色団（発色団に吸収されたエネルギーは後にランタニド（Ln）へ転移され発光に供される）を利用

これらの系からのルミネセンスは、クエンチングの程度にもよるが　約10-6〜10-3秒の典型的長いリン光寿命をもつシャープでかつ分解能の高いバンドから構成される。 リン光測定ユニットを備えたFluoroMax-4Pを用いれば、ランタニドを時間分解にて簡便に測定することができる。

本アプリケーションノートでは、ベンゾフェノン集光型発色団（L、下の図１参照）およびユーロピウム(Eu)イオンあるいはテルビウム(Tb)イオンとの結合錯体からなる2つのランタニド錯体の発光を、 FluoroMax-4Pを用いて時間分解（タイムゲートをかけて）分光測定した結果について記載する。

図1．ベンゾフェノン集光型発色団

実験および結果

励起光源としてキセノンフラッシュランプ(パルス幅　〜約3μ秒)を使用した。 ランプがフラッシュした後の遅延時間（Delay Time）および検出開口幅（Detection Window Size）を一定にした条件でサンプルからのリン光発光スペクトルの測定をおこなった。発光が減衰する間、時間幅の設定を変えてスペクトルを測定することができる。 リン光発光寿命は、検出開口幅（Detection Window Size）をある条件に設定して遅延時間を長くとることで一定の励起波長および発光波長での発光減衰カーブをもとめ、その傾きから算出した(図2)。

図2．リン光の時間分解測定の概要を示した図

Tb-L錯体およびEu-L錯体の各スペクトルを図3および図4に示した。

図3

図4

Tb-LとEu-Lの混合体からの発光スペクトルは、遅延時間0.01msで、サンプリング開口幅10msで測定したとき、Tb-LおよびEu-Lの両方のスペクトルを重ねわせた形状となって示される(図5参照)。
スペクトルにタイムゲートかけて測定すれば、寿命の長さの違いから(Eu-Lの発光寿命は0.60ms程度、一方Tb-Lの発光寿命は1.1ms程度)、2つの化学種からの重なり合ったスペクトルを分離することができる。

図5

タイムゲートのパラメーターを慎重に設定することにより、2つの錯体の混合物から得られるスペクトルを、図6に示すように、初期に得られるスペクトル形状　 (Tb-Lの混入を最小限にし、Eu-Lの混入を最大限とする。)と、後期に得られるスペクトル形状　(Eu-Lの影響を無視できる程度まで抑えほぼ純粋なTb-Lに近い)に分離することができる。

図6

時間分解のマトリックススキャンはスペクトルの時間依存性を示す。遅延時間を連続的に増やしながらスキャンを行うと、複数の発光スペクトルが得られる。これらの結果をX軸に発光強度、Y軸に波長、Z軸に遅延時間をとり3次元で表示した（図7参照）。

図7

結論

フラッシュランプを搭載した蛍光リン光分光光度計FluoroMax-4Pを用いれば、化学種の混合物からの発光スペクトルを時間分解（Time-gating）により分離して測定することができる。

蛍光分光光度計 FluoroMaxを用いた研究へのご提案

生体系サンプルを用いた蛍光測定

概要

生組織を用いた化学、生物学、物理学の研究では正確で迅速なデータ取りが何よりも求められていす。
通常の蛍光分光光度計では　繰り返しスキャンの平均スペクトルを求める方式が提案されます。しかしながら、複数回も強光下でスキャンを繰り返すと脆弱な生体サンプルは簡単にダメージをうけてしまいます。

高い再現性を有し　超高感度な蛍光分光光度計をもちいることで、生体サンプルからの高精度なデータの測定が実現できます。SPEXブランドの蛍光分光光度計を用いれば、DNAやタンパク質からイムノアッセイまで、またキネティック分析から製薬の分野まで、低濃度なサンプルでもより高感度な測定が約束されます。

蛍光分光光度計FluoroMaxを用いた最近のアメリカでの生化学アプリケーションの一例

1. タンパク質、ペプチド　および他生体分子の固有蛍光の測定
2. バイオ活性表面の研究
3. ウィルスアセンブリの研究
4. 温度ダイナミクス　タンパク質内部の構造変化の研究
5. トリプトファン発光、偏光、時間分解の測定
6. 酵素キネティックス　（発光スキャン　および時間依存スキャン）
7. スクリーニングバイオアッセイ、イムノアッセイ、尿中の物質代謝
8. 遺伝子病の変異体領域の構造解析
9. 細胞内ｐH測定のためのリアルタイム時間ベースおよびマルチグループスキャン
10. DNA　濃縮（Condensation）、ヌクレオチド合成、トリプレックスDNA、DNAのタンパク質への結合
11. 血流測定
12. 細胞内カルシウム測定　筋肉中のCa　ATPアーゼ結合
13. 蛍光偏光と酵素反応
14. タンパク質‐リガンドの相互作用の偏光測定
15. トランス細胞膜のポテンシャル、グリコリピッドの転移、In　vivoにおける生体膜研究、バイレイヤーの摂動　さらにErythorocyte ghosts
16. 遺伝子組み換え植物中のGFP（Green Fluorescent proteins)

蛍光分光光度計 FluoroMaxを用いた研究の成果

FluoroMaxを用いた研究の成果は、以下の著名な雑誌に発表されています。

• Analytical Biochemistry
• Biochemistry
• Biochemica et Biophysica Acta
• Journal of Biological Chemistry
• Journal of Molecular Biology
• Protein Science
• Bioconjugate Biochemistry

参考文献については、蛍光分光測定装置 参考文献一覧もあわせてご覧ください。

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株式会社 堀場製作所
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