显微拉曼光谱仪的分析点(激光光斑)尺寸有多大?

显微拉曼光谱仪的激光光斑大小主要由两个因素确定,一是激光波长,二是所使用显微物镜的数值孔径。能够实现的最小光斑尺寸就是衍射极限,根据光学定律,激光光斑直径D可以表示为:

D = 1.22 λ /  NA

其中λ是激发激光波长,NA是所使用显微物镜的数值孔径。例如,采用数值孔径为0.90放大倍数为100倍的显微物镜,波长532 nm激光的光斑直径理论上为721 nm

由此公式可以看出,较短的激光波长能够提供较高的空间分辨率(即:在使用同样的显微物镜条件下,488 nm蓝色激光的光斑就比785 nm近红外激光的光斑小一些),同样,数值孔径较大的显微物镜能够提供较高的空间分辨率(即:使用同一波长激光的情况下,数值孔径0.90的物镜的光斑就比数值孔径0.55的物镜的光斑小一些)。

对上述公式稍作修改,就可得到衍射极限下使用光学显微镜能达到的空间分辨率R的极限:

R = 0.61 λ  /  NA

对于532 nm激光和数值孔径0.90的物镜,理论上空间分辨率为361 nm。然而,该公式适应于标准的光学显微镜,在显微拉曼光谱仪中实际发生的光学过程则要复杂得多。例如,激光光子和拉曼光子的散射以及它们与样品表面的相互作用都会导致空间分辨率下降。因此,通常认为拉曼空间分辨率是在1微米左右,对于某些“优质”样品,空间分辨率可以接近衍射极限。