什么是显微拉曼光谱仪的空间分辨率?

显微拉曼光谱仪的空间分辨率主要由两个因素确定,一是激光波长,二是所使用的物镜的数值孔径。根据光学定律,衍射极限下使用光学显微镜能达到的空间分辨率R可以表示为:

R = 0.61 λ  /  NA

其中λ是激发激光波长,NA是所使用物镜的数值孔径。例如,采用数值孔径为0.90的物镜,在532 nm激光激发下,理论上空间分辨率为361 nm。然而,该公式是基于标准的光学显微镜的,而在显微拉曼光谱仪中实际光学过程则要复杂得多。例如,激光光子和拉曼光子的散射以及它们与样品表面的相互作用都会导致空间分辨率下降。因此,通常认为拉曼空间分辨率约为1微米左右,然而,对于某些“优质”样品,空间分辨率可以接近衍射极限。

由公式可以看出,较短的激光波长能够提供较高的空间分辨率(即:在使用同样的物镜条件下,488 nm蓝色激光的光斑就比785 nm近红外激光的光斑小一些),同样数值孔径较大的物镜能够提供较高的空间分辨率(即:使用同一波长激光的情况下,数值孔径0.90的物镜的光斑就比数值孔径0.55的物镜的光斑小一些)。

值得注意的是,以上公式中涉及到的是横向(XY)的空间分辨率,纵向(Z)空间分辨率更为复杂一些,取决于所采用显微拉曼光谱仪的共焦设计。现今投入使用的共焦设计有几种,其中一些是真共焦的,而另一些是赝共焦的,其实际效果也不尽相同。真共焦设计在光路上安装可以调节的共焦针孔光阑,可以达到1~2微米的纵向分辨率,可以逐层分析多层薄层样品,即可以在纵向进行拉曼切片。最终能达到的纵向分辨率由激光波长、显微物镜和样品的结构决定。

图示多层覆合膜结构的拉曼截面,显示出共焦显微拉曼分析微米厚度的薄层的能力,Z方向总扫描厚度为10微米。
250 nm和350 nm半导体元件的拉曼图像(样品提供:ATMEL ROSSET, 法国Paul Cezanne大学)。