A-TEEMとは？
蛍光吸光分光装置 Duetta は、研究開発向けのハイエンドな蛍光分光測定装置を手掛けてきたHORIBAの蛍光分光技術をふんだんに取り入れたコンパクト蛍光分光装置です。 0.1秒で1100nmまでの発光スペクトルを取得できる斬新なパフォーマンスだけでなく、蛍光と吸光の同時測定機能も持ち合わせた新しいコンセプトの蛍光分光装置です。
A-TEEM:Absorption-Transmission Excitation Emission Matrix
BSAとANS間のFRET分析：
ANS（3×10-6M）を滴下後100ミリ秒ごとの発光スペクトルを測定
高分子の近赤外発光分析：
発光波長1100nmまで高速に発光スペクトル取得可能
強い吸収のある試料の発光分析：
発光と吸光を同時に測定し内部フィルター効果*を自動補正し正しいスペクトルを取得
* 試料自体による吸収が発光スペクトルに及ぼす影響
A-TEEMは、発色性溶存有機物の分析のために、高感度・高速分光技術として開発されました。蛍光性溶存有機物は、CDOM(Chromophoric Dissolved Organic Matter)と呼ばれ、アミノ酸、フミン酸、フルボ酸、およびその他の天然水源の腐敗物質、または水処理プロセスの消毒副産物が含まれます。 以前から、CDOM研究に一般的な蛍光分光光度計が使用されていましたが、これらの装置では測定時間が長く、また、吸光度の高い高濃度の試料の場合、励起光および発光が溶媒で吸収される現象である内部遮蔽効果によって、測定されるスペクトルが歪む現象により、正確な分析が困難であるといった問題がありました。
HORIBA Aqualogは、蛍光、さらに吸光度を同時に測定してこの内部遮蔽効果を自動補正することにより、正確な励起発光マトリクス(EEM)を取得することが可能であることから、シンプルで高速な水質モニタリング技術として、環境水研究のスタンダートとなりつつあります。 また、その正確なモニタリングにより化学処理の最適化に伴う低コスト化に貢献し、世界中の水処理プラントでも使用されています。
Common fluorescent compounds in water include humic acids, fulvic acids, and amino acids (waste water) which can be studied during various treatment processes, by PARAFAC analysis of the A-TEEM fingerprint. Acquired with Aqualog.
HORIBA Aqualogは飲料水処理プラントで使用され、以下のプロセスにおいて水中のパラメーターを分析できます。
プラントに入ってくる原水
沈殿後の沈降水
飲料水として供給される水
主なパラメータは次のとおりです。
2010年にHORIBA Aqualogの発明で初めて構築されたA-TEEM技術は、水質分析の正確かつ高感度かつ高速なソリューションとして使われはじめました。現在、HORIBA Aqualogは多くの新しい産業において斬新な分析手法として採用されており、特に品質管理分野でその効力を発揮しています。 製薬メーカーに対して、HORIBA Aqualogは2つの有望なアプリケーションがあります。 1つ目は細胞培養培地成分のモニタリング、もう1つはワクチンの品質検証です。 どちらのアプリケーションでも、HORIBA Aqualogのシンプルな操作により短時間で結果が得られるため、従来の分析手法に比べて製薬会社に莫大なコストメリットがあります。
哺乳動物細胞培養を使用した蛋白質の製造増加に伴い、生産プロセスで使用する細胞培養培地の品質を管理することがますます重要になっています。 バイオリアクター用の細胞培養培地は通常水溶液で調製され、細胞株が最適な増殖に必要なすべての成分を含み、製品の歩留まりと品質を決定づけます。 培地組成のわずかな違いでさえ、細胞培養の増殖速度とその歩留まりに顕著な影響を与える可能性があります。 そのため、最適なバイオリアクタープロセスを維持するには、バイオリアクター内の細胞培養液の組成と品質を厳密に制御する必要があります。 したがって、細胞培養液の識別と分析は非常に重要です。 製薬業界では、試験の時間、サンプル処理に求められる最小限の要件、および質量分析やクロマトグラフィーと比較した場合のコスト性を検討し、細胞培養培地分析のために蛍光などの分光法に注目し始めました。 バイオリアクター内の細胞培養培地の組成と品質は、最適なバイオリアクタープロセスを維持するために厳密に制御する必要があります。 その結果、細胞培養培地の品質を特定および分析する方法は、この分野で重要な焦点となっています。
| 蛍光成分 | 吸収成分 |
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A-TEEMは、特定のケモメトリックス法（PARAFAC、PCA）により、細胞培養培地の品質を識別および評価するための高速で効果的かつ低コストなソリューションを提供できます。
Figure 1: Examples of cell culture media molecular fingerprint A-TEEMs. The media shown are from the samples DMEM1 (left), HAMSF12 (middle), and RPMI1 (right). Data acquired with Aqualog.
同じ培地の異なる変質であっても、HORIBA Aqualogにより識別することができます。この図は、3つの異なるDMEMサンプルからのすべてのデータを使用して主成分分析（PCA）で生成された3成分のスコアプロットを示しています。HORIBA Aqualogでデータを取得し、Eigenvector SoloソフトウェアでPCA分析を行いました。
ワクチンの力価試験(PotencyTest)の代わりに、HORIBA Aqualogを使用して、単純な光学分析で得られた微妙な分子変動に基づいてさまざまなワクチンを識別できます。サードパーティのCFR準拠のソフトウェアラップとともに、HORIBA Aqualogはレギュレーションに基づく生産プロセスの検証に適用できます。
インスリンは膵臓によって産生されるタンパク質ホルモンであり、基本的な代謝過程に必要です。それは本質的に蛍光性のアミノ酸で構成されています。さまざまな種類の市販のインスリン治療薬があり、一般に2つのカテゴリに分類されます。短時間作用型インスリンと長時間作用型インスリンです。一部の短時間作用型インスリンと長時間作用型インスリンの違いは、場合によっては、タンパク質配列内の1つ、2つ、または3つのアミノ酸のみですが、少しのシーケンスの変更により、インスリンタンパク質の凝集挙動と蛍光残基の局所的な溶媒環境に違いが生じます。A-TEEM蛍光指紋はその微妙な変化を区別できます。
出典：「A-TEEM™, a new molecular fingerprinting technique: simultaneous absorbance-transmission and fluorescence excitation-emission matrix method」、Methods and Applications in Fluorescence、Volume 6、Number 2 2050-6120 / aaa818
ワイン産業において、Aqualogはワインのフェノール類の定量化に貢献できます。この手法は、ワインメーカーが行う従来の分析方法に比べて膨大な時間と費用を節約できるシンプルで高速な分析です。
ブドウ種で決定される何百もの異なる化合物の中で、ワインの品質を根本的に決定するのは、ブドウ果実の熟成のフェノール含有量です。 フェノールのさまざまなクラス（アントシアニン、タンニン、フラボノール、カテキン）は、色、口当たり、風味、香りにさまざまな影響を与え、これらの化合物のほとんどは蛍光を発します。 これらのフェノールを構成する個々の化合物が混合されて、ワインに独特の特徴を与えます。 Aqualogで取得したA-TEEMデータは上流・下流プロセスで使用され、ワインとブドウジュースのロット間、地域、および品種の特性を評価できます。
Classical Least Squared (CLS) analysis of the wines and spirits based upon a library of 9 phenolic compounds for illustrative purposes yields their relative contribution to the total phenolic fingerprint normalized to 100%. Significant differences between wines and spirits are reflected visibly in their phenolic compound fingerprints, acquired with Aqualog.
Fluorescence A-TEEMs (A and B) and corresponding (C and D) Absorbance (OD) and % Transmittance spectra for an Italian wine sample before (A and C) and after (B and D) a one week oxidation treatment acquired on HORIBA Aqualog. (HORIBA App Note: FLSS-38, 2017)
化合物のライブラリーを使用してキャリブレーションされた多変量解析モデルを用いた分析は、ワインとスピリッツを分類および比較することで、偽装、熟成、煙の汚染、SO2処理の定量化などを行うための最速かつ最も簡単な手法です。
Figure 1. EEM contour plot of in-vivo forearm skin. Acquired with Aqualog.
化粧品業界において、Aqualogは肌の状態と日焼け止めの光活性の調査に使用されます。 皮膚の状態評価と日焼け止めの研究では、Aqualog分光計にリモート光ファイバープローブを取り付けて、皮膚の表面から蛍光励起発光マトリックス（EEM）を取得します。 なお、この測定では固体表面からの測定であるため吸光度測定はできません。 皮膚の内因性蛍光は、特定のフルオロフォア（例えば、ポルフィリン、高度糖化最終産物（AGEs）、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）、コラーゲン、エラスチン、トリプトファン、チロシン、NADHフェオメラニン、ユーメラニン、リポフスチンおよびケラチンの成分、ヘモグロビン（発色素））の存在によるものです。 蛍光指紋EEMは、皮膚の内因性マーカーを簡単に識別し、化粧品との相互作用を特徴付けることが示されています。
日焼け止めは、自然光のUVA光線とUVB光線の両方の有害な影響から皮膚を保護します。 それらは、Sun Protection Factor（SPF）によって特徴付けられます。 Aqualogは、日焼け止めを塗布する前後に蛍光指紋EEMを取得することにより、光活性効果を研究できます。 日焼け止めで発生する主な光プロセスは吸収です。 日焼け止めは、外皮層（角質層）に吸収され、光学フィルターとして機能することにより、UV線が内皮層に入るのをブロックします。 したがって、生体内における蛍光の減衰は、日焼け止めに含まれる化合物の保護効果を示すことになります。 高エネルギーUV光のほとんどは、日焼け止めによって変換、分散、または吸収されますが、一定量のUV光が表皮に入ります。 このUV光によって発生する内皮層からの蛍光をとらえることにより、日焼け止めの効果を評価することができます。
Figure 2. Normalized EEM contour plot of in-vivo forearm skin after SPF20 a) and SPF50 b) sunscreen application, showing increasing filtering effects of transmission of excitation light relative to the unprotected skin EEM. Example acquired with Aqualog.
食品アプリの一つとして、Aqualogは、従来の分析方法と比較して、シンプルで高速かつ高感度にオリーブオイルを定量できます。 エキストラバージンオリーブオイル（EVOO）は、最高品質のオリーブオイルであり、そのため、安価なオイルで偽装されることがよくあります（GurdenizG.およびOzenB. Food Chemistry 116（2009）519–525）。 EVOOは、マセレーションや抽出を行わず、収穫後数時間以内に最初にコールドプレスしたオリーブでできています。 オリーブオイルの他のすべての画分は、エクストラバージンオリーブオイルではないものとして分類されます。 A-TEEMの蛍光指紋を取得することにより、偽造品を簡単に識別および検出できます。 以下は、EVOOラベルの付いた7つの商用ブランドのオリーブオイルと1つのブランドのエクストラライト（ELT）のA-TEEM蛍光指紋です。
Figure 1. Chlorophyll and degradation products can easily be seen in the A-TEEM fingerprints of some of these commercial EVOO-labelled olive oils, acquired with Aqualog.
Figure 2. 3-D PARAFAC score plot of edible oils. Note the grouping of EVOO oils in the bottom right corner: The upper left corner features vegetable oils and extra light olive oil. Curiously, the “G” brand EVOO and the “S” brand EVOO are distinct from the rest of the EVOO group, implying the presence of degradation products, as seem in their Aqualog A-TEEM fingerprints. Acquired with Aqualog, PARAFAC analysis using Eigenvector Solo software.
クロロフィル放出領域を除外し、2次元PARAFACスコアプロットを適用することにより、これらのサンプルをさらに精査すると、追加できる情報が明確になります。
Figure 3. 2-D PARAFAC scoreplot reveals that brand “A” moved to the region of brand “G” and brand “S”, while the rest of the EVOO oils stayed together in the bottom right corner of this scoreplot, as acquired with Aqualog. PARAFAC analysis using Eigenvector Solo software.
また、エクストラバージンオリーブオイル中のエクストラライトオリーブオイルの検出限界を、A-TEEMの結果と部分的最小二乗回帰（PLS）を使用して確認することもできます。
Figure 4. PLS analysis of mixtures of EVOO with increasing proportions of purified ELT oil reveals excellent R2 values for calibration and validation, acquired with Aqualog. PLS analysis with Eigenvector Solo software.
ロット間の変動でさえ、同一の商用ブランドの同じEVOO製品内で検出できます。
Figure 5. 3-D PARAFAC scoreplot showing lot-to-lot clustering from a prestigious brand purchased at different times and measured in a single session, acquired with Aqualog. PARAFAC analysis with Eigenvector Solo software.
A-TEEMデータのPARAFAC多変量解析をクロロフィル蛍光領域（500 nmを超える発光）に限定することにより、特定のサンプルの鮮度の迅速な分析も可能になります。PARAFACは、A-TEEM蛍光指紋を、クロロフィルaとフェオフィチンの異なる特徴的な蛍光励起スペクトル（図6）を持つ2つの主要な成分に簡単に分解します。
Fig. 6. Mode 3 loadings corresponding to fluorescence excitation spectra of Pheophytin and Chlorophyll a (Component 1 and Component 2 respectively)
図7では、2019年にニューヨークで開催された第5回オリーブオイル会議のテイスティングプログラムセッションのためにSavantes（www.savantes.org）がスペインとギリシャの生産者から直接入手した最近の収穫から得られたEVOOの一連の分析を示し、以前に収穫され店頭で購入したサンプルと比較もしています。クロロフィルのフェオフィチンへの変化は、パッケージング直後に時間の経過とともに自然に起こり始めるため、その分解生成物であるフェオフィチンと比較したクロロフィルの相対的な量は、製品の鮮度に関連している可能性があります。Aqualogによって同じサンプルでEEMと同時に測定されたK232およびK270の特性値は、直接調達されたすべてのEVOOではなく、一部の店舗で購入されたEVOOについて、IOCガイドライン（それぞれ2.20および0.2未満）を満たすものでありました。
Fig. 7. Relative content of chlorophyll and pheophytin in direct sourced (2019 harvest) and store-bought EVOOs (2018 and 2017 harvest). Avocado oil results are provided for comparison.
