Adam M. GILMORE
HORIBA Jobin Yvon Inc. 

濱上 郁子 Ikuko HAMAGAMI
株式会社 堀場製作所
Readout No.33 August 2007


良質な水資源の確保は,人類の豊かな生活を持続的に支える上で不可欠であり,水質の保全・改善はグローバルな環境課題となっている。水中における様々な生物地球化学的過程に影響をおよぼす溶存有機物(DOM)の水環境中での働きや,起源,動態を正しく理解するためには,その質や量を明らかにする必要がある。DOMに含まれる成分のうち,紫外可視領域の光を吸収する成分は,蛍光性溶存有機物Chromophoric DOM(CDOM)と呼ばれている。有機物または人工化合物から由来するCDOMの光学的特性を用いた簡易分析手法して3次元蛍光分析がある。

本稿では,CDOMを評価するため,HORIBA Jobin Yvon社が新製品として発売した3次元蛍光測定装置「Aqualog(アクアログ)」とそのデータ解析について紹介する。まず,CDOMの3次元蛍光スペクトルと同時に紫外可視吸収スペクトルも測定できるAqualogのハードウェアの特徴について説明する。さらに3次元蛍光スペクトル測定における装置間のデータ比較を可能とするため,分光器,検出器,光路特性等の分析装置に特有なパラメータでの補正や,高濃度の吸収成分による蛍光の再吸収(インナーフィルター効果)の補正について説明する。蛍光分析を用いた水質評価手法がより一般的に認知され,3次元蛍光法(Excitation Emission Matrixs;EEM)による分析が,将来水質の国際標準評価法として認められることを希望する。

はじめに

3次元蛍光分析(EEM)

近年,海洋,河川,湖沼で環境水中の溶存有機炭素Dissolved Organic Carbon(DOC)濃度が増加する傾向が認められ,気温の上昇に伴う泥炭分解速度,水性生物活性,溶存有機物(DOM)の溶解度の増加,さらには年降水量の変化や気候変化が影響しているのではないかと考えられている。

有機物または人工化合物から由来する水中の溶存有機物(CDOM)の光学的特性を用いた簡易な分析手法して,3次元蛍光分析(EEM)を用いた手法が用いられている[1]。
紫外可視域吸収スペクトルと異なり,蛍光スペクトルはいくつかの発光ピークを示すため,DOMの起源や組成,続成作用に関する情報をより多く得ることができる利点がある。また蛍光スペクトルを測定する用途に特化した,この蛍光分光装置は比較的安価で,誰もが簡単に使えて,かつ他の分析装置のような煩雑な前処理等を必要としない(濾過程度の簡便な前処理のみを行えばよい)という利点もある。

蛍光性を有する自然成分としては,植物由来のフミン酸やフルボ酸,動物由来のタンパク質や芳香族アミノ酸成分があり,さらに人工化合物としては,石油系成分,化学肥料,農薬,除草剤,薬品成分,さらに最近では毒性が懸念されるナノマテリアル等がある。

これまでの代表的な河川および湖沼の水質評価の指標として,溶存酸素(DO),全有機炭素(TOC),吸光度,透明度,酸素要求量(河川の汚濁指標として生物化学的酸素要求量Biochemical Oxygen Demand(BOD),海域や湖沼の汚濁指標として化学的酸素要求量Chemical Oxygen Demand(COD)等が使用されている。CDOMも最近,水質評価の指標の一つとして注目されている。
CDOMは直接的に酸素要求量に関連する水質評価の指標とされるが,環境水中ではCDOMが紫外光の暴露により光分解がおこり酸素が消費されるからである。

紫外可視吸収スペクトルと3次元蛍光スペクトル

水中のCDOMの含有量を調べる光学的な手法には,紫外可視吸収スペクトルの測定と蛍光特性を調べる3次元蛍光スペクトル測定がある[1,2,15]。

紫外可視吸収スペクトルは,CDOMが様々な成分の混合物であり,またCDOMの主要な構成要素である腐植成分は電子伝達系が発達しているため,通常特定な ピークを示さず,短波長になるに従って指数関数的に単調に増加する。したがって,Y軸を対数表記した場合には切片と傾きをもって特徴づけられず一次関数に なる。

一方,3次元蛍光スペクトルは,紫外可視吸収スペクトルとは異なり,検出されるピーク位置の違いやスペクトル形状の特徴的な違い等から,腐 植物質をはじめとした有機物や人工化合物に関する情報をより多く得ることができるというメリットがある。しかしこの分析においても,様々な成分からの発光 ピークが重なりあって表示されていることが多く,単純にピークをピッキングするだけではEEMの情報を十分に活用するには難しい。

PLS(Partial Least Squares),PCA(Principal Component Analysis),PARAFAC(Parallel Factor Analysis)は,多変量解析法として知られているが,特にPARAFACはCDOMの重なりあった蛍光ピークを同じ挙動を示す成分ピークに分離する ことができる手法として採用されている。PARAFACは各成分スペクトルを個々に分離し,それぞれのスペクトルに現れたピーク位置を正確にとらえ,その 成分スペクトルのピーク位置を正確に表示できるため,その後の定量的な解析につなげることができる。このことから最近ではPARAFACモデルを 用いた多変量解析をEEM法によるCDOM分析に用いるケースが増えてきている[1-6]。

EEM法によるCDOM分析の課題

PARAFACモデルを使うEEM法によるCDOM分析における課題は,いかにして高精度なスペクトルを再現性よく得られるかということにある[1,2,6,7,9]。このためには以下のような補正を行うことが必須となる。

 1. 励起波長の変化に伴う励起光出力の変化を打ち消すために,3次元蛍光スペクトルは各波長における蛍光と励起光の強度比によりあらわす。
 2. 装置間のデータ比較を可能するために分光器,検出器,光路特性等,装置に特有なパラメータを補正する。
 3. CDOMによる蛍光の再吸収 インターフィルター効果 Inner filter effec(t IFE)を補正する[10-13]。

サンプルによる励起光の吸収が生じ(第1インナーフィルター効果),さらにCDOM成分の吸収帯と蛍光帯の領域がオーバーラップしている場合にはサンプルから発光した蛍光の再吸収が生じる(第2インナーフィルター効果)。実際の蛍光強度は,インナーフィルター効果により,理論値よりも低くなるため,これを補正することはスペクトル解析において重要である。CDOM分析において,成分同定はあくまでも研究者らが作成したスペクトルのライブラリーに基づいて行う。実験室間でデータの比較を行うためには,同定のためのトレーサブルで再現性の高いスペクトルが必要となるが,CDOMの3次元蛍光データを測定した装置や測定条件は論文ごとに異なる点が危惧される[8]。

CDOMの光学的特性を用いた3次元蛍光測定装置「Aqualog」

高感度を有するAqualog(アクアログ)は,水中のCDOMのEEM分析用に開発改良された蛍光測定装置である。
Aqualogは,CCD検出器を搭載しているため,PMT検出器を搭載した従来の蛍光分光光度計よりも高速で3次元蛍光スペクルデータを取得することができる。Aqualogは,スペクトルの精度をあげるために色収差のないミラーを使った光学系と,低迷光タイプのダブル分光器を励起側に採用した。スペクトル補正用蛍光標準物質にはNational Institute of Standards(NIST)製の固形試料を使用している。紫外光を吸収するCDOMを励起できるように紫外域が強化されたランプ光源を搭載した。
Aqualogの装置構成図をFigure 1に示す。

キセノンランプ光源(1)の後段には励起用ダブル分光器(2)が搭載され純度の高い励起光がサンプル室に誘導される。紫外光の吸収によりCDOMが分解されることを防ぐため,励起光は,エネルギーの低い可視域から,よりエネルギーの高い紫外域へ波長をスキャンさせる。励起光はサンプル室(3)の前段に配置されたリファレンス検出器(4a)によって,その強度がモニターされる。サンプル室後段(励起光に対して90度方向)には蛍光測定用にCCDアレイ検出器と一体になったスペクトログラフ(4c)を配置することでEEM分析のデータ取得のスピードを大幅にアップした。

CDOMの研究においては多数サンプルのEEM分析データを測定することが求めらるため測定スピードは重要な装置特性である。装置の制御系は装置ベース部に配置されている(5)。さらに,サンプル室の後段(励起光に進行方向に配置)にはサンプルの透過光を測定するために固体素子検出器(4b)が搭載され,これにより試料の紫外可視吸収スペクトルと3次元蛍光スペクトルの測定を同時に行うことができる。得られた紫外可視吸収スペクトルを用いることで3次元蛍光スペクトルデータにおけるインナーフィルター効果の影響をソフトウェア上で簡単に補正することができる。

Aqualogは,卓上型の小型分析システムにしたことで研究室に導入しやすい価格とサイズを実現しており,また船上等での分析にも使える堅牢性や可搬性も兼ね備えた装置となっている。

Figure 1 CDOMのEEM分析のための卓上型蛍光測定装置「Aqualog」の装置構成図
Figure 1 CDOMのEEM分析のための卓上型蛍光測定装置「Aqualog」の装置構成図

CDOMの吸収スペクトル分析と3次元蛍光(EEM)分析について

Figure 2? An excitation-emission map of the Pony Lake Fulvic Acid standard sample from the International Humic Substance Society?A?. Panel B shows the absorbance spectrum of the sample shown in?A?measured under the same bandpass and integration time conditions

CDOMに対する3次元蛍光測定(Figure 2A)では,セルにいれた水サンプルを240-500 nmの励起波長で励起しながら250-600 nmの蛍光スペクトルを連続的計測する。励起側および蛍光側の分光器のスリット幅はバンドパス5nmに固定されている。励起光は励起源の波長に依存した強度を有するため,蛍光検出器(S)で検出する蛍光シグナルは,各励起波長ごとにリファレンス検出器(R)でモニターした励起源の強度で割り算しなくてならない。加えてリファレンス検出器(R)と蛍光検出器(S)のシグナルは装置ごとのスペクトル感度に対する補正が必要である。

ここで言うスペクトル感度の補正とは,リファレンス検出器(R)のシグナルから暗電流を引き算したものに励起補正スペクトル用の補正ファクター(Xcorrect)を掛け算すること,同様に蛍光検出器(S)のシグナルから暗電流を引き算したものに蛍光補正スペクトル補正ファクター(Mcorrect)を掛け算することである。結果としてAqualogでは最終的にEEMシグナルはSc/Rcとしてソフトウェア上に取得される。ここでSc=(S-dark)×Mcorrect,Rc=(R-dark)×Xcorrectを示す。

3次元蛍光データ測定と同時に,CDOMの紫外可視吸収スペクトルは固体素子検出器(A)によって測定され,I=Ac/Rcとしてソフトウェア上に取得される。ここでAc=(A-dark),Rc=(R-dark)×Xcorrectを示す。サンプルの吸収スペクトルを測定するためにI0=ブランク/リフェレンスサンプルの(Ac/Rc)を測定してAbs=Log(I0/I)として計算する。慣例的に標準サンプルやブランクとして,通常は超純粋(≧18.2 MΩ,全炭素量TOC<2ppb)が用いられる。ブランクはスペクトル分析において3次元蛍光データを補正する際や処理する際に必要となる。


 3次元蛍光(EEM)データの補正プロセスとAqualogソフトウェア