Lin Chandler, Stephen M. Cohen
HORIBA Jobin Yvon Inc.
Readout No.34 January 2009

HORIBA Jobin Yvon(ホリバジョバンイボン)社の新しい蛍光分光光度計FluoroMax™-4 は,自動偏光子ユニット,リン光測定ユニット,時間分解寿命測定ユニット等の多彩なオプションを搭載することができる。遺伝子発現の生化学的研究や,生体 分子間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET),生体環境における蛍光異方性測定に最適な装置である。


はじめに

蛍光分光光度計FluoroMax™-4は,学術研究分野に最適な装置で,生体分子内部または分子近傍の局所環境を研究するため,自動偏光子ユニット,燐光測定ユニット,時間分解寿命測定ユニットが用意されている。本稿ではいくつかの実例を挙げてアプリケーションを紹介する。

モレキュラービーコンを用いた アプリケーション

図1 モレキュラービーコンのループが開くと蛍光が発生する二つの過程(左)cDNAとのハイブリダイゼーション,(右)加熱処理
図1 モレキュラービーコンのループが開くと蛍光が発生する二つの過程(左)cDNAとのハイブリダイゼーション,(右)加熱処理

遺伝子発現の研究において,生体内反応を追跡するため“モレキュラービーコン(一本鎖DNA(ssDNA))”と呼ばれる蛍光基(ドナー)と消光基(アクセプター)を有するヘアピン状のオリゴヌクレオチドが利用される。このヘアピン状部分の両末端は互いに対となる相補的DNA(cDNA)となっており,ハイブリダイゼーションが起こると蛍光基と消光基が近接して蛍光はほとんど発生しない。モレキュラービーコンは酵素の相互作用,cDNAの配列決定,バイオセンシング等の研究に利用されている[1,2]

モレキュラービーコンの消光には,直接的なエネルギー移動と蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)による2つプロセスがある。蛍光基と消光基が接近すれば直接エネルギー移動が起きて熱エネルギーが放散される。一方,より離れた距離(2~10 nm, 20~100 Å)では,蛍光基の発光スペクトルと消光基の吸収スペクトルに重なりが生じFRETが起こる[3]

ssDNAのループがcDNAに遭遇するとヘアピンが自発的に開き,ssDNAとcDNAがハイブリダイズされて,蛍光基と消光基が離れるため,蛍光基からの蛍光発光が増大する(図1)。ハイブリダイゼーションの程度は蛍光強度に比例する。ssDNAは熱の影響によっても開く。ssDNAを加熱すると両腕が分離して蛍光基と消光基が離れるため蛍光を発する。

生化学分野におけるモレキュラービーコンを使った実験の一例を示すものとして,蛍光色素(テトラクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(TET),λem = 447 nm)をssDNAの5'末端に,消光基(QSY)を3'末端に結合させた。蛍光分光光度計FluoroMax™-4を用いてssDNAを521 nmで励起し,サンプルを20~95 ℃の温度範囲において変化させながら525~675 nmの範囲で発光スペクトルを測定した。温度上昇に従ってヘアピンループの腕が離れ,蛍光色素(TET)と消光基(QSY)が遠ざかることにより蛍光発光 が増大する(図2)。

図2  サンプル温度を20~95 ℃の範囲で変化させた場合のTET(蛍光基)およびQSY(消光基)を備えたssDNAの発光スペクトル(λexc = 521 nm) :サンプル温度が上昇するにつれて蛍光基と消光基との距離の増大し蛍光強度が増加する。

蛍光燐光分光光度計による蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の測定

蛍光分光光度計FluoroMax™-4に燐光測定ユニットを装備したシステムを蛍光燐光分光光度計 FluoroMax™-4Pと呼んでおり,強い短寿命の蛍光による妨害を受けることなく長寿命の燐光のみを効率よく測定することができる。この燐光測定によって化学や生化学における種々の興味深い系について重要な情報を得ることができる。その一例としてドナーであるペプチド・テルビウム複合体からアクセプターであるフルオレセインへの蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)がある。複合体中のペプチドは280 nmの励起光を吸収して365 nmで発光する。テルビウムは365 nm付近でこの光を吸収して,485 nmで燐光を発生する。この燐光をフルオレセインが吸収して発光が起こる。燐光測定ユニットを用いて,280 nmの光で複合体を励起したとき520 nmでフルオレセインからの蛍光発光を観測する。

ペプチド・テルビウム複合体を水溶液とし,いくつかの試料にはフルオレセインを加えた。光源には燐光測定用にキセノンフラッシュランプを用い,検出器には光電子増倍管(R928)を用いた。燐光測定ユニットを備えたFluoroMax™-4P では,光パルスにより試料を励起し,検出ウインドウを開くタイミングと長さを可変的に制御できる。この測定では試料を280 nmの光で励起して100回のフラッシュで測定した。燐光スペクトル検出において積算時間は0.2 sに設定した。スペクトルのスキャンは常温常圧で行った。

燐光種はテルビウム(Tb)であることが実験から確認された。ペプチド・テルビウム複合体にフルオレセイン0.67 μMを加えた場合と加えない場合,キセノンフラッシュランプによるパルス励起の間に50 μsの遅延時間のある場合とない場合について,3つの発光種(ペプチド,テルビウム(Tb),フルオレセイン)に対するプロットを図3に示した。363 nm付近の偽発光は,検出ウインドに50 μsの遅延時間を与えることで除去する。図3において,赤色の曲線で示すように遅延時間をかけない状態では蛍光と燐光が混じった状態で発光スペクトルが測定される。青色と緑色の曲線からフルオレセインの有無に関する違いが容易に比較され,511 nmにおけるフルオレセインの燐光発光は複合体からフルオレセインへのエネルギー移動によって起こることが示される。

図3 ペプチド・テルビウム・フルオレセイン複合体の蛍光スペクトル
(赤線)フルオレセイン0.67 μM添加,励起後の遅延時間なし
(緑線)フルオレセイン0.67 μM添加,励起後の遅延時間50 μs
(青線)フルオレセイン添加なし,励起後の遅延時間50 μs
励起側および発光バンドパス5 nm。50 μsの遅延時間により
フルオレセインへのエネルギー移動による蛍光が除かれている。

図4  テルビウム-フルオレセイン複合体の発光減衰曲線  解析フィッティングにより求めた発光寿命τ = 1.41 ms(χ2 = 1.033)
図4  テルビウム-フルオレセイン複合体の発光減衰曲線  解析フィッティングにより求めた発光寿命τ = 1.41 ms(χ2 = 1.033)

時間相関単一光子計数(TCSPC)方式の時間分解寿命測定ユニットを用いて寿命測定を行ったところ(図4),ドナーのみの蛍光寿命TD(図示なし)が1.77 msに対して,テルビウム-フルオレセイン(ドナーとアクセプター)複合体の蛍光寿命TDAは1.41 msであった。複合体の蛍光寿命の方が短いことはエネルギー移動を示唆している。

 

蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の効率Eは式(1)で求められる。

フェルスター(Förster)距離R0 は43.4 Å。ドナーとアクセプターとの距離RDAはこのR0の値を用いて式(2)[4]により求められる。


 蛍光異方性を用いたアプリケーション