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Parag Dharapm, MD 1, Sebastien Raimbault, PhD2
1. Centro de Diagnóstico do Dr. Dharap, Mumbai, Índia, 2 HORIBA Medical R&D, Montpellier, França
Embora transmitidas por diferentes subespécies de insetos vetores, a malária e a dengue frequentemente coexistem em áreas endêmicas economicamente desfavorecidas de países em desenvolvimento. A sintomatologia comum representa um desafio para os profissionais de saúde. Encorajada pelo desempenho de um algoritmo de sinalização de malária desenvolvido anteriormente com técnicas modernas de aprendizado de máquina em contadores de células sanguíneas, HORIBA decidiu desenvolver ferramentas semelhantes para triagem de dengue, bem como para a identificação de subespécies de parasitas da malária, como parte de um esforço contínuo de melhoria. Neste estudo, avaliamos o desempenho dessas sinalizações no analisador HORIBA Yumizen H550.
O crescimento populacional descontrolado, a urbanização mal planejada, os recursos inadequados para a saúde pública e a falta geral de conscientização são possivelmente as principais causas do ressurgimento de uma das doenças virais mais comuns, a dengue, em regiões tropicais e países em desenvolvimento. Com as monções intensas e imprevisíveis, a dengue tornou-se uma das principais doenças infecciosas que representam uma ameaça à saúde pública.
Embora transmitidas por diferentes subespécies de insetos vetores, a malária e a dengue frequentemente coexistem em áreas endêmicas economicamente desfavorecidas de países em desenvolvimento. Além dos mosquitos como vetores, ambas as doenças compartilham períodos de incubação semelhantes em humanos, de 5 a 6 dias, juntamente com sinais e sintomas similares de doença febril aguda, com ou sem mialgia, hepatoesplenomegalia e trombocitopenia. A ausência de outros achados clássicos representa um desafio para os médicos, que constantemente buscam uma diferenciação precisa e rápida entre esses importantes problemas de saúde pública para um melhor manejo terapêutico.
Além das características comuns mencionadas acima, diversos estudos documentaram anormalidades em parâmetros hematológicos como hemoglobina, hematócrito, CHCM (concentração de hemoglobina corpuscular média), leucopenia, anormalidades na população de leucócitos, bem como anormalidades em parâmetros bioquímicos, incluindo testes de função hepática.
Bhargava et al. sugeriram o uso de fatores discriminantes baseados no Volume, Condutividade e Propriedades de Dispersão dos Leucócitos (Tecnologia VCS) em analisadores Beckman Coulter para o diagnóstico rápido de Malária e Dengue. Mesmo após a introdução da tecnologia de PCR para Dengue e Malária em uma plataforma global, a necessidade de instrumentação especial, o tempo de processamento e as restrições econômicas a mantêm fora do alcance da maioria das pessoas. O método padrão ouro para detecção do parasita da malária por exame de esfregaço de sangue periférico, embora seja o mais utilizado e econômico, exige conhecimento técnico especializado e pode necessitar de testes repetidos, aumentando o tempo de resposta. Da mesma forma, para a infecção por Dengue, testes de triagem que detectam a presença de antígenos e/ou anticorpos específicos da doença, preferencialmente pela técnica ELISA, que requerem instrumentação adicional, são utilizados como principal método para intervenções terapêuticas.
Incentivada pelo desempenho de aplicações anteriores de algoritmos de sinalização de malária, desenvolvidas por meio de técnicas contemporâneas de aprendizado de máquina em contadores de células sanguíneas ABX Pentra XLR (um contador diferencial de cinco partes com técnica de contagem de reticulócitos) e Microsemi CRP (um contador diferencial de três partes com PCR), HORIBA decidiu desenvolver ferramentas semelhantes para triagem de dengue, bem como avaliar a possibilidade de realizar a subespeciação de parasitas da malária, como parte de um esforço contínuo de melhoria. Neste estudo, avaliamos o desempenho desses algoritmos de sinalização no analisador HORIBA Yumizen YH550, uma nova plataforma para o mercado de baixo e médio porte.
Hemácias infectadas por malária no gráfico de dispersão de leucócitos Yumizen H550
Um total de 1436 pacientes que compareceram ao Centro de Diagnóstico Dr. Dharap, em Mumbai, Índia, para exames hemograma completo de rotina, entre julho e outubro de 2018, foram estudados. Amostras de sangue residuais foram analisadas em série no analisador HORIBA Yumizen H550. Os padrões éticos locais foram seguidos; no entanto, o consentimento informado não foi necessário, visto que o estudo foi realizado anonimizando as amostras de sangue retidas sem custos adicionais e sem comunicar os resultados ao médico, de forma a não interferir no diagnóstico e tratamento do paciente. Além do critério primário de seleção de pacientes (febre), o exame microscópico de esfregaço sanguíneo para pesquisa de parasitas da malária e a confirmação por teste antigênico para antígenos NS1 da malária e da dengue foram realizados em todos os casos.
Para a triagem de casos de malária, foram utilizados kits de teste rápido de detecção de antígeno da malária, fabricados pela SD Biosensor Healthcare Pvt. Ltd., Gurugram, Índia, que empregam anticorpos monoclonais anti-P. falciparum HRP-11 (0,75 ± 0,15 µg) e anti-P. vivax pLDH (0,75 ± 0,15 µg), respectivamente, para detectar a presença de antígenos relacionados a P. falciparum e P. vivax. Para a triagem e o diagnóstico de dengue, foi utilizado o teste RecombiLISA NS1 Antigen, que utiliza pares de anticorpos policlonais e monoclonais específicos anti-dengue para os quatro sorotipos (DEN1, 2, 3 e 4) e possui sensibilidade analítica de 0,3 ng/ml para o antígeno NS1 tipo 2. O teste foi fabricado pela CTK Biotech, Inc., Estados Unidos da América.
Todas as amostras foram identificadas e selecionadas para avaliação com testes de triagem/diagnóstico e revisão microscópica por um patologista experiente. As amostras foram agrupadas em casos normais, positivos para malária e positivos para dengue. Os casos de malária foram posteriormente classificados por meio de revisão microscópica em alta magnificação de 2.000 hemácias por um patologista experiente, para identificação da espécie, formas dominantes do ciclo de vida e densidade parasitária. Indivíduos que realizavam exames de rotina sem histórico de doenças específicas foram considerados para o grupo normal ou controle (N = 60). As amostras foram analisadas (N = 1424, positivas para *Plasmodium vivax* N = 184, positivas para *Plasmodium falciparum* N = 21, dengue N = 213, outras febres N = 933) com um software integrado de instrumento protótipo, comparando os resultados de sinalização obtidos com os testes confirmatórios.
Os resultados gerais mostram uma AUC significativa para esses indicadores. Um ponto de corte ideal de 0,31 foi identificado para o indicador Vivax.
Pacientes febris: Os resultados são semelhantes para este subgrupo de pacientes em que esses indicadores são úteis na prática clínica.
Pacientes com malária confirmada: A capacidade de identificação das espécies de malária é demonstrada pela especificidade do marcador *Vivax*.
Excluindo casos positivos de malária com parasitemia < 0,1% de hemácias: o desempenho está claramente ligado ao nível de parasitemia.
Pacientes com menos de 12 anos: Apresentam baixo desempenho do indicador de dengue, que carece de alta especificidade e provavelmente é desencadeado por outras infecções virais através da ativação de linfócitos e outras alterações não específicas observadas em infecções virais.
Muitas doenças afetam diferentes parâmetros das células sanguíneas de forma direta ou indireta, resultando em alterações detectáveis ou indetectáveis na contagem de células sanguíneas. Diversos estudos sugerem combinações de diferentes parâmetros e índices medidos por instrumentos para melhorar a eficiência no processo de diagnóstico da malária. Técnicas de aprendizado de máquina assistidas por computador consideram um conjunto de todos esses parâmetros medidos para identificar e aproveitar aqueles com maior poder de distinção e significância.
Os resultados deste estudo indicam que, com o auxílio de técnicas de aprendizado de máquina assistidas por computador, é possível desenvolver uma ferramenta eficaz, econômica e útil (indicadores de suspeita) para prever, rastrear e diagnosticar "assinaturas" específicas de doenças como malária e dengue. A insuficiência de casos positivos para Plasmodium falciparum foi uma limitação deste estudo. Um estudo de validação multicêntrico de maior porte pode trazer mais informações e maior poder de discernimento a esta técnica de baixo custo, com resultados comparáveis aos de tecnologias mais caras, como despolarização de luz, fluorescência de DNA/RNA e sinais de dispersão de luz, e alterações na população celular utilizadas em outros analisadores.
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