Tecnologia

Sistema Sequencial Hidrodinâmico Duplo (DHSS)

A tecnologia Double Hydrodynamic Sequential System (DHSS) é uma tecnologia da HORIBA. Sua importância reside em garantir um fluxo linear de células por meio de impedância elétrica e medição óptica, o que auxilia na diferenciação precisa das sub-população de leucócitos, juntamente com as plaquetas. O foco hidrodinâmico duplo é uma técnica utilizada para fornecer resultados precisos em citômetros de fluxo. O DHSS contribui para uma abordagem especializada na análise sanguínea.

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1. As células passam pela abertura uma a uma (① na Figura 1) para serem contadas e medidas pela corrente elétrica (alterações de impedância). Esta é a medição resistiva do volume celular.

2. Em seguida, cada uma atravessa o feixe de luz que chega em um ângulo de 0° (➁ na Figura 1), determinando a complexidade das células.
• Parte da luz é absorvida pelo conteúdo da célula.
• A maior parte é desviada pela estrutura celular (luz dispersa),
• O restante da parte passa através da célula ou ao redor dela.

Os analisadores HORIBA Medical utilizam uma combinação de medição óptica e impedância elétrica para contar e analisar as células à medida que passam por um sistema de eletrodos de microabertura. O impulso do eletrodo é então usado para contar o número de células, medir o tamanho e a distribuição de leucócitos, eritrócitos e trombócitos.

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Princípios de Medição LMNE

O reagente especial Nucediff HORIBA lisa os eritrócitos e estabiliza os leucócitos (glóbulos brancos) em suas formas nativas. Cada célula é então medida tanto em extinção óptica (estrutura interna) quanto em resistividade (volume), o que permite a contagem total de células nucleadas e a contagem diferencial de linfócitos, monócitos, neutrófilos, eosinófilos, linfócitos atípicos, populações imaturas e eritroblastos.

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O princípio de detecção do LMNE baseia-se na citometria de fluxo do Sistema Sequencial Hidrodinâmico Duplo (DHSS). Duas características de cada célula que passa por este sistema são determinadas: volume e extinção da luz óptica.

Descrição da matriz e das células

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Figura 3: 1 = Linfócitos 2 = Monócitos 3 = Neutrófilos 4 = Eosinófilos 5 = Linfócitos imaturos (IML) 6 = Monocíticos imaturos (IMM) 7 = Granulocíticos imaturos (IMG) 8 = Eritroblastos ou agregados plaquetários 9 = Ruído de fundo baixo 10 = Ruído de fundo alto

A partir das medições de extinção e resistividade dos leucócitos, desenvolve-se uma matriz com os volumes celulares no eixo X e a extinção no eixo Y. O estudo da imagem da matriz permite uma clara diferenciação das sub populações de leucócitos.

Os limiares populacionais das células (algumas móveis e outras fixas) estabelecem os limites normais para as morfologias normais dos leucócitos. Alterações na morfologia de uma população específica são indicadas na matriz por um deslocamento na população correspondente.

Os limiares fixos (Figura 3) aparecem em preto e os limiares móveis em vermelho na imagem abaixo. Os limiares azuis seguem os vermelhos ao ajustar a matriz. A matriz permite o cálculo da porcentagem da população de leucócitos conforme esta figura:

Eritroblastos (NRBC)

Os eritroblastos são glóbulos vermelhos imaturos com núcleo. O citômetro de fluxo detecta os núcleos das células NRBC liberadas após a lise de suas membranas pelo Nucediff. Devido ao seu pequeno tamanho e baixa absorbância, eles se posicionam na parte esquerda da população de linfócitos na matriz (quadro nº 8 da Figura 3). Nessa zona, também podemos encontrar agregados plaquetários. O instrumento consegue diferenciá-los dos eritroblastos graças a algoritmos específicos. Em todos os casos, os agregados de NRBC e plaquetas não são incluídos na contagem de leucócitos.

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Morfologia celular com DHSS:

Nos analisadores HORIBA, a medição da extinção é feita utilizando uma fonte óptica de baixa coerência. Essa fonte óptica de baixa coerência caracteriza-se pelas diferentes componentes espectrais e espaciais do feixe de luz. Essa medição revela a morfologia das diferentes organelas celulares, por um lado, e as características intracitoplasmáticas, por outro. A alta abertura numérica do feixe de luz permite a observação das células.

Essa medição é menos sensível à anisotropia celular e à sua posição ou orientação no feixe (Figura 4), e fornece informações dependendo das características intrínsecas da célula.

Fonte de luz coerente de baixa intensidade:

Em luz policromática, utilizando um feixe de baixa coerência espacial (feixe divergente), a medição é menos sensível à posição ou orientação da célula no feixe.

Por que usar luz coerente de baixa intensidade e não luz laser?

Dada a complexidade da estrutura e morfologia dos leucócitos, o método de identificação e contagem que combina citoquímica e medição de luz coerente de baixa intensidade (iluminação de baixa coerência) demonstra ser mais discriminatório e robusto em comparação com os métodos a laser.

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	Laser	Lâmpada de luz coerente de baixa intensidade
Vantagem	Alta potência na célula de fluxo (90% da fonte de luz). Adequado para fluorescência.	Nitidez do perfil de intensidade do feixe. Ruído muito baixo (alta frequência).
Limitação	Luz ruidosa, manchas, Difícil de usar para medições de volume precisas. Forma de luz gaussiana.	Baixa eficiência (0,0004%). Consumo de energia elétrica, emissão térmica. Não é adequado para fluorescência.

As medições ópticas realizadas nos analisadores Yumizen permitem fornecer informações mais precisas sobre o volume, a relação núcleo-citoplasmática e a estrutura interna de cada célula, e essa robustez é particularmente útil para a identificação de anormalidades.

Análise de extinção óptica de plaquetas

Semelhante à análise de leucócitos (WBC), a contagem de plaquetas é realizada utilizando o sistema sequencial hidrodinâmico duplo quando as amostras são processadas no modo PLT Ox. O modo PLT Ox diferencia a população de plaquetas da população de eritrócitos (RBC) com base no índice de refração. O princípio de medição é similar ao do LMNE.

1. Após a diluição, a solução é transferida da câmara para a bancada óptica por aspiração, antes de ser analisada na câmara de medição. A diluição é revestida com um revestimento hidrodinâmico duplo e passa pela abertura da célula de fluxo LMNE e pela janela óptica. Cada célula é medida tanto em resistividade (volume) quanto em absorbância (citoquímica).

2. A partir dessas medições, é elaborada uma matriz com volumes no eixo X e extinção óptica no eixo Y.

Figura 6: Representações matriciais do PLTOx

PLT Ox:

Este parâmetro corresponde à porcentagem de plaquetas em relação aos eritrócitos identificados na matriz, multiplicada pela contagem de eritrócitos identificada na câmara. Não é necessário calibrar este parâmetro, pois ele depende da calibração dos eritrócitos. Simultaneamente, o instrumento executa um ciclo de baixo valor de eritrócitos/plaquetas.

Como o Sistema Sequencial Hidrodinâmico Duplo melhora a precisão da análise hematológica?

O foco hidrodinâmico utiliza o fluxo de bainha para controlar a taxa de amostragem dentro da abertura e direcionar o fluxo da amostra ao longo do eixo central da abertura. Neste sistema hidrodinâmico sequencial duplo HORIBA, ele é utilizado para evitar que os efeitos de borda alterem os resultados e ajuda a alinhar as partículas na mesma orientação.

O que é o efeito de borda?

A presença de gradientes elétricos mais intensos nas bordas de um campo elétrico do que no centro pode influenciar a precisão, distorcendo a amplitude do pulso elétrico e resultando em uma superestimação do tamanho da partícula. Isso ocorre quando as partículas passam pela microabertura em posições diferentes. A situação é ainda mais complexa devido à orientação da partícula através da abertura.

O uso do DHSS evita muitos dos problemas potenciais inerentes a um sistema de abertura. O fluxo da amostra é envolvido por um fluido de revestimento à medida que passa pelo eixo central da abertura. O fluxo laminar permite que o fluxo central da amostra se estreite o suficiente para separar e alinhar as células em fila única para passagem pela zona de detecção. O fluido de revestimento externo elimina a recirculação de células de volta para a zona de detecção.

Referências

1. Kachel V; Dimensionamento do pulso de resistência elétrica: Dimensionamento Coulter. Citometria de fluxo e triagem. Segunda edição, T. Willy & Sons, 1990; p. 45-80.
2. Al Quddus N, Moussa WA e Bhattacharjee S., Movimento de uma partícula esférica em um canal cilíndrico usando o método arbitrário Lanrangiano-Euleriano., J. Colloid and Interface Science, 2008; 317:620-630.
3. Patente europeia EP 0 425 381, Aparelho para contagem e determinação de pelo menos uma subpopulação de leucócitos. Data de depósito: 25 de outubro de 1990; Lefevre D; Champseix H.; Champseix S.
4. CÉLULAS SANGUÍNEAS: Um Guia Prático, Barbara J. Bain, Quarta edição (2006) Blackwell Publishing. Barbara J. Bain, Professora de Hematologia Diagnóstica no Campus do Hospital St. Mary's da Faculdade de Medicina do Imperial College de Londres e Consultora Honorária em Hematologia no Hospital St. Mary's de Londres.
5. Óptica de Partículas Biológicas, Série II: Matemática, Física e Química – Vol. 238 Série Científica da OTAN; Alfons Hoestra, Universidade de Amsterdã, Holanda. Valeri Maltsev, Instituto de Cinética Química e Combustão, Novosibirsk, Rússia. Gorden Videen, Laboratório de Pesquisa do Exército, Adelphi, MD, EUA, Universidade de Amsterdã, Holanda.
6. Lasers e técnicas ópticas atuais em biologia, série abrangente em fotoquímica e fotobiologia - volume 4 RS.C, Giuseppe Palumbo Dipartemento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare”L.Califano”, Università di Napoli “Federico II”, Napoli, Itália. Riccardo Pratesi Dipartimento di Fisica, Università di Firenze, Sesto Fiorentino (Fi), Itália.
7. Biologia das Células Sanguíneas, Óptica e Tecnologias Relacionadas, Relatórios Técnicos de Leitura HORIBA, edição em inglês nº 8, agosto de 2004. Philippe Nerin, Diretor de Pesquisa da Horiba Medical, PhD, Didier Lefèvre, Departamento de P&D
8. Determinação do volume, forma e índice de refração de plaquetas sanguíneas individuais; IV Kolesnikovaa,b, SV Potapovb, MA Yurkinb,c, AG Hoekstrac , VP Maltseva,b e KA Semyanovb, a Universidade Estadual de Novosibirsk, Rua Pirogova, 2, 630090, Novosibirsk, Rússia b Instituto de Cinética Química e Combustão, Filial Siberiana da Academia Russa de Ciências, Rua Institutskaya, 3, 630090, Novosibirsk, Rússia c Faculdade de Ciências, Seção de Ciência Computacional, da Universidade de Amsterdã, Kruislaan 403, 1098 SJ, Amsterdã, Holanda.
9. COMPREENDENDO OS PLANOS CONJUGADOS E A ILUMINAÇÃO DE KÖHLER Michael W. Davidson e Thomas J. Fellers; Laboratório Nacional de Altos Campos Magnéticos, Universidade Estadual da Flórida, 1800 E. Paul Dirac Dr., Tallahassee, Flórida 32306.