Fluorescência - Análise de reticulócitos

HORIBA utiliza citometria de fluxo e medição de impedância com um reagente chamado ABX Fluocyte, que contém o corante fluorescente laranja de tiazol (TO), um corante cianina cuja excitação ocorre na região visível em λ = 488 nm. Trata-se de um corante específico para ácidos nucleicos que penetra nas células por permeabilidade. Quando se liga ao RNA, ocorre um aumento de 3000 vezes na emissão de fluorescência. É um dos corantes recomendados pelas diretrizes NCCLS-CLSI para a contagem de reticulócitos. O TO tornou-se o corante mais comumente empregado devido à sua precisão de contagem e praticidade para laboratórios clínicos com citômetros de fluxo comerciais com lasers visíveis de potência relativamente baixa.

O grau de emissão de fluorescência causado pelo corante ligado à excitação é proporcional à quantidade de RNA no eritrócito.

Após a coloração das células, a suspensão é transferida para a bancada óptica a laser para ser medida. A bancada óptica a laser mede simultaneamente a fluorescência das células que passam pelo ponto de medição em direção à célula de fluxo, e o volume por impedância. A passagem de uma célula pela célula de fluxo fornece dois tipos de informação:

• O tamanho da célula é medido pela resistividade CIS (Sinal de Impedância da Célula).
• Luz de Fluorescência Ortogonal (OFL): A fluorescência é coletada usando uma lente focada na célula de fluxo óptico e localizada a 90° do feixe de luz, um filtro interferencial específico para o corante TO, que seleciona apenas o comprimento de onda fluorescente, e um tubo fotomultiplicador.

A matriz de reticulócitos é gerada a partir de duas medições: volume de resistividade (CIS) e fluorescência ortogonal (OFL) das células, respectivamente nos eixos X e Y. Hemácias maduras sem RNA apresentam pouco ou nenhum sinal fluorescente. Elas estão localizadas na base da matriz e distribuídas horizontalmente de acordo com seu VCM (Volume Corpuscular Médio) e RDW (Amplitude de Distribuição dos Eritrócitos). Os reticulócitos são separados das hemácias pela sua fluorescência, que é proporcional ao conteúdo de RNA e ao seu grau de imaturidade. Os elementos mais fluorescentes, que estão saturados no topo da matriz, são os mais imaturos. Eritroblastos também podem ser encontrados nessa região.