Análise óptica de plaquetas

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As plaquetas, ou trombócitos, são fragmentos citoplasmáticos em forma de disco, normalmente presentes no sangue periférico. As plaquetas circulantes são produzidas a partir de megacariócitos, principalmente na medula óssea. As plaquetas maduras, embora pequenas, normalmente entre 2 e 20 fL, em comparação com os eritrócitos ou leucócitos, desempenham um papel importante tanto na hemostasia primária, juntamente com os fatores de coagulação, quanto na resposta inflamatória do organismo.

Parâmetros associados às plaquetas

Distúrbios plaquetários quantitativos e qualitativos são comuns, e a contagem de plaquetas é vital para avaliar o risco de um determinado paciente desenvolver sangramento espontâneo. A concentração de plaquetas (PLT) é um parâmetro básico do hemograma completo (HC). Os índices plaquetários (IP) — plaquetócrito (PCT), volume plaquetário médio (VPM), amplitude de distribuição plaquetária (ADP) e relação plaquetas-células grandes (RPC) — são um grupo de parâmetros plaquetários derivados, obtidos como parte do HC automatizado. O volume plaquetário médio (VPM) é calculado dividindo-se o plaquetócrito (PCT), análogo ao hematócrito eritrocitário, pelo número de plaquetas (1). O VPM, medido por analisadores hematológicos automatizados, reflete o tamanho médio das plaquetas em circulação. Sabe-se que indica síntese acelerada de plaquetas pela medula óssea em resposta ao aumento da destruição periférica de plaquetas (2). A ADP é a largura da curva de distribuição do tamanho das plaquetas (3). A relação plaquetas-células grandes (P-LCR) é definida como a porcentagem de plaquetas que excedem o valor normal de volume plaquetário de 12 fL na contagem total de plaquetas. Ela é calculada em analisadores hematológicos automatizados utilizando a fórmula:
P-LCR = P-LCC/PLT, onde P-LCC é a contagem de plaquetas grandes. O tamanho das plaquetas reflete sua atividade; portanto, MPV (Volume Plaquetário Médio) e P-LCR são um método simples e fácil de avaliação indireta da estimulação plaquetária.

Métodos de contagem de plaquetas

Os quatro principais procedimentos para contagem de plaquetas são: manual – microscopia de contraste de fase, impedância, dispersão óptica de luz/fluorescência e citometria de fluxo, além da contagem imunológica.
Até recentemente, o método de contagem manual era a referência com a qual todos os métodos automatizados eram comparados. Embora demorado, ainda é realizado na rotina laboratorial em caso de baixa contagem de plaquetas ou se plaquetas atípicas estiverem presentes na amostra. A introdução de contadores automáticos de sangue total resultou em uma melhora drástica na precisão e reduziu significativamente o tempo necessário para a análise, quando comparado ao método manual. Ainda assim, os contadores automáticos têm suas limitações e o método de referência atual para contagem de plaquetas é uma combinação de citometria de fluxo por fluorescência e contagem por impedância de abertura (4).

No método de contagem de plaquetas por impedância, as células são consideradas partículas resistivas completamente não condutoras. Quando uma célula sanguínea suspensa em solução eletrolítica passa pela zona de detecção de uma abertura, observa-se uma mudança detectável na impedância elétrica, proporcional ao volume da célula. Cada célula individual emite um sinal de impedância, que é proporcional ao volume da célula detectado. Utilizando essa relação entre o sinal de impedância e o tamanho da célula/partícula, elas são posteriormente classificadas em duas categorias celulares:

• Células pequenas – 2 a 30 fL – relacionadas às plaquetas
• Células maiores – 30 a 200 fL – relacionadas à faixa de contagem de glóbulos vermelhos (hemácias).

Uma das principais desvantagens do método de impedância elétrica na contagem de plaquetas é a dificuldade em distinguir plaquetas grandes de hemácias extremamente microcíticas ou fragmentadas, leucócitos anucleados fragmentados e outras partículas de tamanho semelhante, resultando em um aumento falso na contagem de plaquetas relatada. Essa dificuldade se deve ao discriminador baseado no tamanho utilizado para separar as plaquetas das hemácias. Por outro lado, em amostras contendo plaquetas grandes, bem como agregados plaquetários com tamanho > 30 fL (como observado em casos com aglutininas dependentes de EDTA), será relatada uma diminuição falsa. Finalmente, pode-se observar uma variação significativa na reprodutibilidade dos resultados entre diferentes analisadores devido às diferenças nas técnicas analíticas utilizadas pelos diferentes fabricantes.

Mais recentemente, métodos de dispersão óptica de luz foram introduzidos para a contagem de plaquetas. As células, em um diluente adequado, passam por um feixe estreito de luz (por exemplo, laser de hélio-neônio). A iluminação e a dispersão de luz por cada célula são medidas em um único ângulo (unidimensional) ou em dois ângulos (bidimensional) de dispersão de luz. O volume e o índice de refração de plaquetas individuais são determinados simultaneamente, célula por célula. As duas medidas de dispersão são convertidas em valores de volume (tamanho da plaqueta) e índice de refração (densidade da plaqueta) usando a teoria de Mie para dispersão de luz em esferas homogêneas. A análise integrada é então usada para distinguir plaquetas, plaquetas grandes, hemácias, fragmentos celulares e detritos (5). As plaquetas são identificadas no mapa do citograma de dispersão de plaquetas com base em seu volume e índice de refração (1,35–1,40).

Na contagem óptica fluorescente de plaquetas, um corante polimetínico é usado para corar o RNA/DNA das células reticuladas, bem como a membrana e os grânulos das plaquetas. Dentro da câmara de fluxo, cada célula individual passa pelo feixe de luz de um laser de diodo semicondutor. Essa tecnologia permite a contagem simultânea de reticulócitos, eritrócitos e plaquetas fluorescentes. A intensidade da fluorescência de cada célula é analisada, o que possibilita a separação das plaquetas dos eritrócitos e dos reticulócitos.

Detecção óptica de plaquetas em analisadores HORIBA

No modo PLTOx dos analisadores Yumizen, dois métodos de medição, impedância e extinção de luz (absorvência), são combinados para obter o resultado mais confiável (Figura 1).

Figura 1: Método de medição PLT Ox HORIBA Medical utilizando uma fonte de luz incoerente

O princípio de medição é semelhante ao do LMNE. Após a diluição da amostra, a solução passa pela abertura da célula de fluxo do LMNE e pela janela óptica. Cada célula é medida tanto em resistividade (volume) quanto em extinção óptica (citoquímica). A densidade de plaquetas ou o índice de refração da célula determina o grau de dispersão da luz e, portanto, a absorvência ou extinção óptica. A partir dessas medições, é construída uma matriz com os volumes no eixo X e a absorvência óptica no eixo Y (Figura 2).

Figura 2: Matriz exibida para a diferenciação de plaquetas/hemácias com base em medição óptica.

Como as medições de impedância e ópticas de cada célula são feitas com um atraso, existe um algoritmo associativo que funde ambas as medidas. Isso permite uma representação matricial semelhante a um diagrama de dispersão. A representação matricial permite uma melhor classificação quando as populações se sobrepõem em uma ou ambas as medições. A luz de extinção é sensível ao índice de refração, permitindo diferenciar, para o mesmo tamanho, uma plaqueta de um eritrócito (Figura 2). Ao mesmo tempo, o instrumento executa um ciclo de baixo valor para eritrócitos/plaquetas.

O parâmetro PLTOPT corresponde à porcentagem de plaquetas em relação aos eritrócitos identificados na matriz, multiplicada pela contagem de eritrócitos identificada na câmara de medição. Não há necessidade de calibrar esse parâmetro individualmente, pois ele depende da calibração dos eritrócitos.

A tecnologia de fonte de luz incoerente

A tecnologia de medição de extinção plaquetária HORIBA utiliza uma fonte de luz incoerente (fonte estendida). A alta abertura numérica do feixe de luz permite a observação das células a partir de diferentes ângulos, revelando a morfologia dos diferentes compartimentos celulares, por um lado, e as características espectroscópicas intracitoplasmáticas, por outro.

Ao contrário de um laser de luz monocromática que gera um feixe perfeitamente paralelo e, consequentemente, permite a visualização da célula em uma única dimensão, a medição feita com uma fonte de luz incoerente é menos vulnerável à anisotropia celular e à sua posição ou orientação no feixe, fornecendo informações que dependem das características intrínsecas da célula (Figura 3).

Figura 3: Dispersão espectral da luz (esquerda) comparada à dispersão gerada por laser (direita)

Com uma fonte de luz espectral como a luz monocromática de um laser, o sinal relacionado à característica da célula depende muito da posição e orientação da célula no ponto de medição e precisa estar centralizado no eixo. Caso contrário, a resposta da luz pode ser distorcida e apresentar resultados diferentes, como demonstrado na Figura 4.

Figura 4: Dispersão da luz espectral (esquerda) comparada à dispersão gerada por laser (direita)

Quando a luz incide sobre uma célula, ela é difratada de uma maneira específica. As propriedades de dispersão da luz estão relacionadas à morfologia celular. A abertura numérica (AN) de um sistema óptico é uma medida da sua aceitação angular para a luz incidente. Em estudos de PLT com tecnologia baseada em laser, a AN é menor e corresponde a cerca de 11% da luz difratada total. Com a tecnologia de luz incoerente HORIBA, a AN maior resulta em uma luz difratada correspondente a cerca de 88% da luz difratada total (Figura 5); a análise é, portanto, muito melhor e mais precisa.

Contagem imunológica de plaquetas

O princípio da contagem imunológica consiste em marcar o sangue anticoagulado com EDTA com um anticorpo monoclonal antiplaquetário adequado, conjugado a um fluoróforo (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína FITC). Vários desses anticorpos já foram descritos, incluindo anti-CD42a; anti-CD41b; anti-CD61; e anti-CD41, anti-CD42 e anti-CD61.

Figura 5: Tecnologias de feixe de luz laser e incoerente e suas respectivas aberturas numéricas (AN) e padrões de difração.

A amostra é então analisada utilizando um citômetro de fluxo. O método deriva a contagem de plaquetas da proporção de plaquetas fluorescentes em relação aos glóbulos vermelhos na amostra. A contagem imunológica de plaquetas realizada com um citômetro de fluxo é precisa e confiável; no entanto, essa técnica teria um custo significativo se aplicada a todas as amostras em um contador de células sanguíneas totalmente automatizado.

O método de contagem de plaquetas de referência

Para a atribuição de valores de calibração de analisadores hematológicos e materiais de controle, o Conselho Internacional de Padronização em Hematologia (ICSH) e a Sociedade Internacional de Hematologia Laboratorial (ISLH) recomendam a contagem de plaquetas especificamente marcadas em relação aos eritrócitos com um citômetro de fluxo de fluorescência, juntamente com uma contagem precisa de eritrócitos determinada com um contador de impedância de abertura semiautomático de canal único como método de referência para a enumeração de plaquetas.

Portanto, vários métodos e tecnologias são combinados para obter o resultado mais confiável. Amostras de sangue venoso fresco anticoagulado com EDTA são medidas em até 4 horas após a coleta. A amostra é pré-diluída e as plaquetas são marcadas com dois anticorpos monoclonais específicos para um cluster de diferenciação (CD) comum a todas as plaquetas. Pelo menos 50.000 eventos, com um mínimo de 1.000 eventos de plaquetas, são contados com um citômetro de fluxo para determinar a relação entre hemácias e plaquetas. A contagem de plaquetas é então calculada a partir dessa relação e da concentração de hemácias da amostra de sangue original (6).

Inferência

As plaquetas são componentes sanguíneos complexos com funções variadas. Seu número, forma, volume e índices plaquetários associados são marcadores de diferentes estados patológicos (7, 8). As tecnologias de contagem de plaquetas evoluíram ao longo do tempo e o método de contagem de referência atual combina diversas tecnologias. Devido ao custo e ao acesso limitado a essas tecnologias, o método de contagem de referência não pode ser aplicado a todas as amostras em análises de rotina.

Com sua tecnologia exclusiva de luz incoerente, combinada à contagem de impedância e à representação matricial clara da relação RBC/PLT, os analisadores HORIBA oferecem uma solução ideal, o mais próxima possível do método de referência, para essa análise de rotina multifacetada.

Referências

1. YU Budak, M. Polat e K. Huysal: O uso de índices plaquetários, plaquetócrito, volume plaquetário médio e amplitude de distribuição plaquetária em cirurgia abdominal não traumática de emergência: uma revisão sistemática, Biochem Med (Zagreb). 10 de junho de 2016; 26(2): 178–193.
2. JD Bessman: A relação da ploidia dos megacariócitos com o volume plaquetário, American Journal of Hematology, fevereiro de 1984; 16(2):161-70.
3. D. Schmoeller, MM Picarelli, T. Paz Munhoz, CE Poli de Figueiredo e H. Luiz Staub: Volume Plaquetário Médio e Fração Plaquetária Imatura em Doenças Autoimunes; Fronteiras na Medicina, 06 de setembro de 2017
4. P. Harrison, K. Ault, S. Chapman, L. Charie, B. Davis, K. Fujimoto, B. Houwen, J. Kunicka, F.Lacombe, S. Machin, R. Raynor, L. van Hove, O. van Assendelft,, Um estudo interlaboratorial de um método de referência candidato para contagem de plaquetas. Jornal americano de patologia clínica. Março de 2001; 115(3):448-59.
5. C. Briggs, P. Harrison e SJmachin: Desenvolvimentos contínuos com a contagem automatizada de plaquetas; International Journal of Laboratory Hematology, 2007, 29, 77–91.
6. Painel de Especialistas em Citometria do Conselho Internacional de Padronização em Hematologia* e Força-Tarefa da Sociedade Internacional de Hematologia Laboratorial sobre Contagem de Plaquetas†. Contagem de plaquetas pelo método da relação eritrócitos/plaquetas. Am J Clin Pathol 2001; 115:460-464
7. P. Harrison, C. Briggs, S. Machin: Avanços na contagem de plaquetas, Hematologia. 2001;5(6):421-7.
8. AY Gasparyan, L. Ayvazyan, DP Mikhailidis, GD Kita: Volume plaquetário médio: uma ligação entre trombose e inflamação?; Current Pharmaceutical Design. 2011;17(1):47-58.