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Parag Dharap 1, Sébastien Raimbault 2, Sylvie Arnavielhe 3, Gérard Dray 4, Stefan Janaqi 4, Michel Plantié 4, Pierre Jean 4, Vincent Derozier 4, Shubham Rastogi 5
1 Centro de Diagnóstico do Dr. Dharap, Mumbai, Índia, 2 Departamento de Inovação, HORIBA Medical, Montpellier, França, 3 Kyomed, Montpellier, França, 4 LGI2P/EMA, Nimes, França, 5 HORIBA Medical, Nova Délhi, Índia
A triagem contadora de células sanguíneas para a presença de malária vem sendo investigada há >20 anos. A eficiência reportada variou conforme a metodologia e o desenho do estudo. Vários fabricantes introduziram a sinalização de malária em instrumentos de alta linhagem, com relatos afirmando sensibilidade e especificidade >80%. No entanto, a realidade econômica é que áreas endêmicas de malária normalmente utilizam instrumentos de baixo e médio alcance. Aplicamos técnicas contemporâneas de aprendizado de máquina computacional para desenvolver algoritmos de sinalização para detecção de malária, utilizando dois contadores de sangue HORIBA médicos de faixa baixa a média. A validação incluiu pacientes com febre da dengue, que apresentam sintomatologia clínica semelhante à da malária.
Duzentas e noventa amostras de sangue foram analisadas em série utilizando os seguintes instrumentos e modos de teste: Microsemi CRP (hemograma completo com diferencial de 3 partes + modo CRP) e Pentra XLR (diferencial de 5 partes ou análise de reticulócitos fluorescentes). A seleção das amostras utilizou três categorias diagnósticas confirmadas por teste de antígeno: saudáveis, positivos para malária e positivos para dengue. Os casos confirmados de malária foram posteriormente classificados em P. vivax (N=103) e P. falciparum (N=29) e microscopicamente classificados quanto ao estágio de desenvolvimento predominante (esquizoítos, anel ou ameboide). Amostras normais (N=70) e casos de dengue (N=87) foram considerados negativos para malária para a determinação da sensibilidade, especificidade, valores preditivos negativo e positivo, taxa de classificação correta e razões de verossimilhança positiva e negativa. Técnicas de mineração de dados foram utilizadas para identificar os parâmetros dos instrumentos que apresentaram diferenças significativas entre malária e normal em um conjunto de treinamento de 550 casos (232 positivos para malária), e os algoritmos de sinalização desenvolvidos incluíram a ponderação dos parâmetros que apresentaram maior poder discriminatório. O número de parâmetros selecionados dentre os testados para o indicador de suspeita de malária variou conforme o instrumento (Microsemi CRP, 59 de 886; PXLR DIFF, 412 de 25.994; PXLR Retic, 402 de 26.395) com as técnicas de mineração de dados e aprendizado de máquina. As amostras foram analisadas com o software do instrumento integrando o indicador de suspeita de malária, e os resultados foram comparados aos testes confirmatórios.
A malária é uma das doenças transmissíveis mais comuns no mundo, afetando populações em todas as regiões tropicais. É uma doença potencialmente fatal causada por parasitas transmitidos aos humanos pela picada de mosquitos Anopheles fêmeas infectados. Cerca de 3,2 bilhões de pessoas – quase metade da população mundial – estão em risco de contrair malária. A malária é a principal causa de morbidade na África. É um grave problema de saúde pública, com estimativas da OMS apontando para 207 milhões de casos e 6.270.000 mortes em todo o mundo em 2012.
Diversos analisadores hematológicos relataram a capacidade de detectar a presença de infecção por malária utilizando vários parâmetros, com diferentes níveis de eficiência. Os analisadores da Abbott utilizaram despolarização da luz e corantes fluorescentes de ácidos nucleicos (1-3), os instrumentos da Beckman Coulter utilizaram algoritmos offline desenvolvidos a partir de parâmetros de posição ou tamanho celular (4-6) e a Sysmex, da mesma forma, utilizou parâmetros de tamanho celular na matriz de leucócitos e alterações na fluorescência da matriz de eritrócitos ou reticulócitos para o seu indicador de malária (7-12, também copiado pela Mindray). Em comum a todos esses métodos de detecção de malária, seja por meio de um indicador automático ou pela interpretação do usuário de padrões de dispersão, está o fato de que menos de quatro parâmetros são utilizados na detecção de alterações sanguíneas associadas à infecção por malária.
HORIBA Medical optou por desenvolver um sistema automatizado de sinalização de suspeita de malária utilizando técnicas de mineração de dados para examinar todos os parâmetros gerados pelos instrumentos Microsemi CRP, Pentra XL e Pentra XLR, a fim de determinar aqueles mais úteis para distinguir malária de infecções tanto saudáveis quanto não malária. Utilizando essas técnicas modernas de aprendizado de máquina, foram aplicadas mais de 500 amostras de pacientes, incluindo não apenas casos positivos para malária e saudáveis, mas também um grupo de pacientes com dengue, que apresenta quadro clínico semelhante ao da malária (mesmos sinais e sintomas). A partir desses arquivos de dados, 412 de 25.994 parâmetros para o Pentra XL e Pentra XLR no modo CBC+Diff, 402 de 26.395 para o Pentra XLR no modo Retic modificado e 59 de 886 variáveis para o Microsemi CRP foram identificados como tendo poder discriminatório para malária. A partir desses parâmetros úteis, um algoritmo de sinalização foi desenvolvido e utilizado neste estudo de validação.
Foram incluídas no estudo 290 amostras de pacientes, selecionadas de grupos diagnósticos de indivíduos normais, positivos para malária ou positivos para dengue, com cada amostra analisada em duplicata. Testes rápidos de diagnóstico de antígeno, fabricados pela SD – Bio Standard Diagnostics Pvt Ltd; Gurgaon, Índia, foram utilizados para triagem de Plasmodium falciparum (proteína II rica em histidina), Plasmodium vivax (lactato desidrogenase de Plasmodium) e dengue (antígeno NS1 e/ou anticorpo IgM).
Todos os casos de malária foram confirmados por microscopia e classificados quanto às formas predominantes do ciclo de vida (trofozoítos, esquizoítos, gametócitos).
As amostras de sangue foram analisadas em duplicado em um instrumento HORIBA Medical Pentra XLR (hemograma hemograma com 5 partes e análise de reticulócitos à base de tiazol laranja) usando tanto o modo CBC DIFF quanto novamente com modos retéticos de ganho de fluorescência modificados (diminuídos) e em um instrumento Microsemi CRP (contagem diferencial de 3 partes e proteína C reativa no sangue total) tanto no modo CBC+Diff quanto no modo CBC+Diff+CRP.
Os resultados foram analisados estatisticamente quanto à eficiência, sensibilidade, especificidade, índice J de Youden positivo, acurácia da classificação, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo do indicador de suspeita de malária, em comparação com os métodos laboratoriais usuais para confirmação da doença.
Figura 1: Resumo do processo de mineração de dados. Todos os parâmetros medidos e gerados pelo contador de sangue, incluindo contagens, informações do histograma e posições na matriz de plotagem, são comparados para cada categoria diagnóstica (normal; malária positiva e dengue). As diferenças entre os grupos diagnósticos são normalizadas tanto para diferenças negativas quanto positivas. As variáveis com capacidade discriminatória são identificadas e ponderadas no algoritmo de sinalização desenvolvido para classificar a malária como distinta de indivíduos saudáveis e pacientes com dengue.
Tabela 1: Desempenho da sinalização de suspeita de malária no Pentra XLR usando os modos CBC e DIFF. O número de resultados verdadeiros negativos (VN), falsos negativos (FN), verdadeiros positivos (VP) e falsos positivos (FP) é determinado para a sinalização em análises duplicadas. A análise estatística para valor preditivo negativo (VPN), valor preditivo positivo (VPP), razão de verossimilhança positiva (RVP), razão de verossimilhança negativa (RVN), índice J de Youden com taxa de classificação correta, especificidade e sensibilidade são bons tanto para A, malária versus todas as amostras negativas (normais e com dengue) quanto para B, malária versus amostras normais.
Tabela 2: Desempenho da sinalização de suspeita de malária no Pentra XLR usando os modos CBC e DIFF. A análise estatística para valor preditivo negativo (VPN), valor preditivo positivo (VPP), razão de verossimilhança positiva (RVP), razão de verossimilhança negativa (RVN), índice J de Youden; taxa de classificação correta; especificidade e sensibilidade são igualmente boas para A, P. vivax versus todas as amostras negativas (normais e com dengue) e B, P. falciparum versus amostras normais.
Tabela 3: O desempenho da sinalização de suspeita de malária no modo RETIC Pentra XLR é igualmente bom tanto para A, malária versus todas as amostras negativas (normais e com dengue) quanto para B, malária versus amostras normais. No entanto, o modo de análise de reticulócitos modificado não apresentou melhor desempenho em relação ao modo CBC + DIFF.
Tabela 4: O desempenho da sinalização de suspeita de malária no Pentra XLR usando o modo CBC + DIFF (A) e Pentra XLR usando o modo RETIC (A) mostra uma distinção igualmente boa entre amostras de malária e dengue.
Tabela 5: Desempenho do indicador de suspeita de malária no Microsemi CRP usando o modo CBC + diferencial de 3 partes + CRP. O desempenho estatístico é igualmente bom tanto para A, malária versus todas as amostras negativas (normais e com dengue) quanto para B, malária versus amostras normais.
Tabela 6: Resumo do desempenho do indicador de suspeita de malária no Pentra XLR e Microsemi CRP para todos os modos testados e comparação entre os vários grupos clínicos (Todos = normal + dengue).
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