Fluoreszenz-Lifetime-Techniken: TCSPC, FRET, TRES und SSTD

TCSPC steht für zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung. Es handelt sich um eine Methode, bei der das Timing einer gepulsten Anregungsquelle, wie einem Laser oder LED, mit dem Zeitpunkt der Ankunft einzelner Photonen auf einem Detektor genutzt wird, um den Lebenszeitabfall über viele Ereignisse (Wiederholung von Pulsen und detektierten Photonen) zu rekonstruieren. Diese Technik basiert darauf, dass die Wahrscheinlichkeit, ein einzelnes Photon zum Zeitpunkt t nach einem anregenden Impuls zu detektieren, proportional zur Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt t ist.

Die Wiederholung eines Lasers oder einer LED, die mit relativ hoher Wiederholungsrate (10 kHz bis 100 MHz) gepulst wird, wird mit der Zeit synchronisiert, zu der das nächste Photon einen Detektor erreicht (d. h. PMT). Zeit-Elektronik in Form eines Zeit-zu-Digital-Wandlers oder Zeit-zu-Amplituden-Wandlers (TAC) wird verwendet, um diese Ereignisse nacheinander aufzuzeichnen, bis genügend Statistiken gesammelt wurden, um den Zerfall zu rekonstruieren. Der Zerfall wird dann an eine Exponentialfunktion angepasst, um den Lifetime decay (t) zu modellieren. TCSPC wird typischerweise verwendet, um Fluoreszenz-Lifetime von der Pikosekonde bis zur Mikrosekunde zu messen.

Mit dem kinetischen TCSPC-Modus können individuelle Messungen in nur 1 ms durchgeführt und bis zu 10.000 Messungen nahtlos erfasst werden. Solange eine Änderung der Fluoreszenz-Lifetime auftritt, kann dieser Ansatz und nicht die Intensität verwendet werden, um einen kinetischen Prozess zu verfolgen.

Offensichtlich sind genügend Photonen erforderlich, um die Daten analysieren zu können. Dies kann durch eine sehr hohe Wiederholungsrate verbessert werden, aber Lifetime und Zeitspanne müssen berücksichtigt werden, damit die Probe nicht vor vollständigem Zerfall erneut angeregt wird. Die Lifetime-Daten können dann verwendet werden, um kinetische Spuren für den Prozess zu konstruieren.

Wenn man Fluoreszenz messen kann, kann man auch FRET (Förster-Resonanzenergieübertragung) messen. FRET ist die Interpretation des Messergebnisses und nicht eine Messtechnik. FRET tritt auf, wenn die Emission eines Donormoleküls mit der Absorption eines Akzeptormoleküls überlappt. Wenn die beiden sich nahe genug sind, durchlaufen sie eine Dipol-Dipol-Wechselwirkung und es wird Energie übertragen. Der Abstand, bei dem 50 % Übertragungsenergie vorhanden sind, wird als Förster-Entfernung bezeichnet, und dieser Wert ist typischerweise für gängige RET-Paare bekannt. Durch Messung der Änderung der Fluoreszenzintensität oder Lifetime des Donormoleküls in Anwesenheit des Akzeptors kann die FRET-Effizienz und damit der Abstand zwischen beiden berechnet werden. FRET kann entweder mit Fluoreszenzspektren (Intensitäten) oder Fluoreszenz-Lifetimes gemessen werden.

Mehrere Messungen sind erforderlich; ID, die Intensität (oder t_D, die Lifetime), gemessen am Emissionspeak des Spenders allein, I_DA, die Intensität (oder t_DA, die Lifetime), gemessen am Emissionspeak des Donors in Anwesenheit eines Akzeptors, I_A, die Intensität (oder t_A, die Lifetime), gemessen am Emissionspeak des Donators mit Anwesenheit eines Akzeptors, aber nicht des Donators, und I _B, die Intensität (oder t_B, die Lifetime), gemessen am Emissionspeak des Donors mit Blanklösung (d. h. nur Puffer). Aus diesen kann der Wirkungsgrad E zusammen mit dem Förster-Abstand (R₀) verwendet werden, um R zu berechnen, also den Abstand zwischen den zu messenden Donor- und Akzeptormolekülen. Siehe die Gleichungen in der obigen Abbildung.

Quenching bezeichnet die Verringerung der Fluoreszenzemissions, d. h. eine Erhöhung der nicht-strahlenden Zerfallsrate (knr). Abschrecken lässt sich in "statische" und "dynamische" Formen unterteilen. In beiden Fällen nimmt die Emissionsintensität ab, aber nur beim dynamischen Abschrecken ändert sich die Lifetime der Fluoreszenz. Hinweis: Wenn die Kinetik der Stern-Volmer-Kinetik folgt und eine durchschnittliche Lifetime verwendet wird, sollte dies mit dem Intensitätsmittelwert berechnet werden.

Die Wirkung der Photobleaching verlängert die Messlaufzeit, da sie effektiv die Anzahl der emittierenden Fluorophore reduziert (d. h. wie eine Abnahme der Konzentration) und die Emissionsintensität reduziert. Die Lifetime bleibt unverändert.

Die zeitaufgelöste Emissionsspektralmessung ist eine Technik, die den Fluoreszenzabfall bei inkrementellen Wellenlängen über das Emissionsspektrum einer Probe misst. Ein 3D-Diagramm von Intensität versus Zeit versus Wellenlänge wird erhalten. Indem man diesen 3D-Datensatz in Richtung der Spektren zu unterschiedlichen Zeiten statt bei unterschiedlichen Wellenlängen betrachtet, kann das zeitaufgelöste Emissionsspektrum gemessen werden. Wenn eine Probe mehrere Emitter mit überlappenden Spektren, aber unterschiedlichen Lifetimes enthält, können die einzelnen Spektren dieser Komponenten mittels TRES getrennt werden.

Zum Beispiel wird 2-Naphthol ionisiert und bildet im angeregten Zustand 2-Naphtholat. (Koti, 2001). Das Emissionsspektrum im stationären Zustand zeigt zwei Spitzen, was darauf hindeutet, dass beide Arten vorhanden sind. Die Messung der Lifetime bei inkrementellen Wellenlängen über das Emissionsspektrum zeigt bei jedem Emissionspeak sehr unterschiedliche Zerfallsraten. Durch die Anpassung der Zerfälle kann man sehen, wie sich die Lifetime und/oder Amplituden der Komponenten bei unterschiedlichen Emissionswellenlängen ändern.

Für 2-Naphthol hat der Emissionspeak von 2-Naphthol bei 354 nm eine andere Lifetime als der von 2-Naptholat, der einen Emissionspeak um etwa 414 nm aufweist. Das 2-Zustands-Modell des ionisierten und nicht-ionisierten 2-Naphthols ist im TRES deutlich dargestellt. Zwei Zeitkonstanten repräsentieren die unterschiedlichen Zerfallszeiten von 2-Naphthol (3,4 ns dominant bei 357 nm) und 2-Naphtholat (9,4 ns dominant bei 414 nm). Die unten gezeigten Daten wurden an einem FluoroMax-4 mit FluoroHub-TCSPC-Elektronik und einer NanoLED-280-Anregungsquelle gemessen, die mit 1 MHz arbeitet.

Eine weitere Anwendung von TRES ist die Messung von Lösungsmittel-Reorientierungszeitkonstanten. (Horng, 1995). Indem man ein einzelnes Fluorophor betrachtet und wie sich das Emissionsspektrum im Laufe der Zeit verschiebt, kann die Spitzenenergie im Verhältnis zur Zeit dargestellt und angepasst werden, um eine Zeitkonstante zu erhalten. Die Verschiebung des Spektrums kann in diesem Fall darauf zurückzuführen sein, dass Lösungsmittelmoleküle ihre Dipolmomente als Reaktion auf ein angeregtes Dipolmoment des Fluorophors neu ausrichten. Durch die Anpassung der Spitzenenergie des Emissionsspektrums über die Zeit kann die Reorientierungszeitkonstant(en) der Lösungsmittelmoleküle ermittelt werden. (Horng, 1995).

Ja. Es gibt ein paar Möglichkeiten, das zu tun, je nach Probe. Eine kinetische TCSPC-Messung kann durchgeführt werden, um die Bindung zu überwachen, falls sich die Lifetime während des Bindungsprozesses ändert. Zeitaufgelöste Anisotropie kann ebenfalls angewendet werden, da die Bindung die Rotationskorrelationszeit beeinflusst. Da dies auf die Änderung der effektiven Größe des Moleküls zurückzuführen ist, ist die Rotationskorrelationszeit proportional zum effektiven Volumen des Moleküls.

In einem Beispiel wird eine Verzögerung verwendet, nachdem die Lampe geblinkt hat, um das Phosphoreszenzspektrum zu messen. Ohne Verzögerung können sowohl die kurzlebige Fluoreszenz des Peptids in dieser Probe als auch die länger lebende Phosphoreszenz des Terbiums beobachtet werden.

Durch Variation der Verzögerung kann man selektiv Arten mit längerlebiger Phosphoreszenz nachweisen, getrennt von der Hintergrundfluoreszenz in derselben Probe.

Die Zusammensetzung von Lanthaniden in Glasmaterialien kann mittels zeitaufgelöster Phosphoreszenzzerfall untersucht werden. Hier sind Daten aus der Untersuchung des Erbiumgehalts in verschiedenen Gläsern mit diesem Verfahren. Die Lifetime des Erbiums kann je nach Glasart und Verfahren variieren, die zur Glasherstellung verwendet werden.

Die Boxcar-Technik, oder Boxcar Amediaging, ist eine Methode, um eine Phosphoreszenz oder langanhaltenden Fluoreszenzzerfall zu messen, indem an festen Integrationsfenstern über die Zerfallszeit des Signals integriert wird.

Eine gepulste Quelle, wie eine Xenon-Blitzlampe, wird geblinkt und eine Verzögerung wird nach dem Impuls eingestellt (idealerweise zu einem Zeitpunkt, zu dem der Lampenblitz abgeschlossen ist). Der Detektor misst ein Integrationsfenster wiederholt, um einen statistischen Durchschnitt der Intensität an diesem Fenster nach dem Blitz zu erhalten. Anschließend wird das Integrationsfenster schrittweise über den Zerfall auf längere Zerfallszeiten verschoben. Auf diese Weise entsteht ein Zerfall und kann mit einem exponentiellen Zerfall kombiniert werden, um die Lifetime mit der Inverse der Zerfallsrate zu bestimmen. Die Güterwagentechnik kann sehr langsam sein, besonders bei langanhaltenden Zerfall und schwachen Emittern. Je nach Breite des Xenonimpulses können jedoch Lifetimes zwischen 10 μs und Sekunden relativ kostengünstig mit einer abstellbaren Lichtquelle aufgelöst werden.

SSTD steht für Single Shot Transient Digitizer. Die SSTD-Technik verwendet eine gepulste Lichtquelle, entweder einen gepulsten Laser oder eine Xenon-Blitzlampe, um von jedem Blitz der gepulsten Quelle eine vollständige Phosphoreszenzabfallkurve zu erfassen. Nach jedem Impuls wird der Zerfall in Echtzeit mit einem PMT und einem Transienten-Digitalisierer erfasst und digitalisiert. Eine schnelle Signalmittelung ist leicht möglich, da nach jedem Schuss ein vollständiger Abfall gemessen wird. Die zeitaufgelösten Spektren können leicht durch numerische Integration des Zerfallsignals innerhalb des benutzerdefinierten Zeitbereichs und durch das Abtasten eines Monochromators gemessen werden. Dies ermöglicht eine Differenzierung von Spektren basierend auf der Lifetime des jeweiligen angeregten Zustands.

Fluoreszenzemission findet auf der Skala von Pikosekunde bis Nanosekunde statt, während Phosphoreszenz, die mit SSTD gemessen wird, auf der Mikrosekunden- bis Sekundenskala auftritt. Indem man die zeitliche Position und die Breite des Signal-Etektionsgatters variiert, kann man selektiv Fluoreszenz- und Phosphoreszenzspektren nachweisen, wie die Phenanthrenspektren auf der begleitenden Abbildung belegen. Hier wurde die Emission von Phenanthren in einem gefrorenen Glas mit einer allmählich erhöhten Zeitverzögerung des Detektionsgatters gemessen, um den Beitrag der Fluoreszenz zu verringern.

Ein Beispiel für die Anwendung von SSTD findet sich im Fall der Raumtemperaturphosphoreszenz (RTP) von Nase T1-Tryptophan. Hier wurde das Signal extrahiert, indem die überwältigende Tryptophan-Fluoreszenz ausgeschlossen wurde, was mit einer kontinuierlichen Anregungsquelle extrem schwierig gewesen wäre. Der Phosphoreszenzabfall der sehr schwachen Emission wurde auf demselben Instrument ebenfalls mit der Funktion Single Shot Transient Digitizer (SSTD) gemessen (HORIBA PTI QuantaMaster Series, 2017).

Die stroboskopische optische Boxcar-Technik wird auch als Stroboskop-Technik bezeichnet. Es handelt sich um eine Zeitdomänen-gepulste Technik, bei der eine gepulste Lichtquelle blitzen lässt und dann ein PMT aktiviert wird, indem ein sehr kurzzeitiger Hochspannungsimpuls die Dynodekette des PMT hinuntergeleitet wird. Anschließend werden diese Blitze wiederholt und mithilfe eines Verzögerungsgattergenerators wird die Intensität zu einem anderen Zeitpunkt nach dem Blitz gemessen, um eine Abklingkurve zu konstruieren. Diese Methode verwendet dann mehrere Blitze und Mittelwerte, um das Signal-Rausch-Verhältnis des Zerfalls zu verbessern.

Die Strobe-Technik ist eine analoge Technik, die von Natur aus weniger empfindlich als TCSPC ist und keine echte Poisson-Statistik wie TCSPC bietet. Es hat jedoch den Vorteil, mit niedrigen Wiederholungsquellen wie Laserdioden, LEDs, abstimmbaren Q-geschalteten OPOs oder Stickstoff-/Farbstofflasern Abklingzeiten von etwa 150 ps auf Sekunden zu ermöglichen. Die Strobe-Technik kann zeitaufgelöste Spektren direkt messen, indem die Position des Verzögerungsgatters fixiert und der Emissionsmonochromator abgetastet wird.

Einer der Vorteile des Strobe ist, dass er Zerfall sowohl in linearen als auch in nichtlinearen (d. h. arithmetischer Progression und logarithmischen) Zeitskalen sammeln kann. Letzteres hilft erheblich bei der Auflösung von multiexponentiellen Zerfällen, bei denen die Lifetimes um Größenordnungen variieren können. Ein weiterer Vorteil der Strobe-Technik ist, dass sie mit abstimmbaren Lasern mit niedriger Wiederholrate funktionieren kann, wie Q-geschaltet/OPO oder Stickstoff/Farbstoff, die nicht mit TCSPC verwendet werden können. Er kann auch mit LEDs und Laserdioden arbeiten, die bis zu etwa 25 kHz arbeiten.

Ein Beispiel für die mit Stroboskop gemessene Lifetime ist die Analyse von Zerfall und Verteilung von ZnO-Objektträgern, wie in der folgenden Abbildung gezeigt.

Die Fluoreszenz-auf-Umwandlung ist ein Prozess mit zwei Photonen, bei dem eine Probe von zwei gleichzeitigen Photonen, die gleichzeitig im nahen infraroten Wellenbereich eintreffen, angeregt wird und die Fluoreszenz mit höherer Energie (niedrigerer Wellenlänge) im sichtbaren Bereich des Spektrums emittiert wird.

Während die benötigte Anregungsleistung von der jeweiligen Probe abhängt, erfordert die Hochumwandlung typischerweise eine Anregungsquelle mit höherem Photonenfluss, wie etwa einen Laser. Aus diesem Grund verfügen Standard-TCSPC-Quellen möglicherweise nicht über den erforderlichen Fluss für Aufwandlungsmessungen. Laser, die 980 nm ausgeben, können direkt auf ein Probenkompartiment montiert werden, um Proben direkt anzuregen und so Aufwärts-Umwandlungsspektren, Lifetimes oder sogar Quantenausbeute zu messen. Q-geschaltete OPO-Laser mit effizientem NIR-Ausgang können ebenfalls zur Messung der Fluoreszenz-Hochkonvertierung verwendet werden.

Moleküle, die Licht im NIR absorbieren und im sichtbaren Bereich detektiert oder sogar abgebildet werden können, sind nützlich. Dies liegt daran, dass hochenergetische UV-Anregungsquellen dazu neigen, in biologischen Proben zu photobleichen oder Fotoschäden zu verursachen. NIR-Quellen werden bei niedrigerer Energie angeregt und haben dieses Problem typischerweise nicht. Moleküle, die eine Fluoreszenz-up-conversion aufweisen, sind Lanthanide, Halbleiternanopartikel und Quantenpunkte. Der gleiche 980-nm-DPSS-Laser kann durch TTL-Pulse gepulst und für die PL-up-conversion Lifetime-Messungen verwendet werden, entweder mit der MCS-Funktion der TCSPC-Platine oder der SSTD-Technik.

Obwohl Fluoreszenz (und Phosphoreszenz) ein breites Anwendungsspektrum hat, gibt es zwei Hauptforschungsgebiete, in denen die Nutzung dieses Phänomens herausragt:

• Lebenswissenschaften
• Materialwissenschaft

In jeder Umgebung, in der stationäre Fluoreszenz vorkommt, kann es vorteilhaft sein, Lifetime-Methoden zur Informationsgewinnung anzuwenden. Einige dieser Anwendungen und Fluoreszenztechniken, die in ihrer Studie eingesetzt werden können, sind unten dargestellt.

Life Sciences

Materialwissenschaften