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Wie man das Signal-Rausch-Verhältnis berechnet
Bestimmung des Signal-Rausch-Verhältnisses eines Spektrofluorometers: Methoden und Formeln zur Sicherstellung genauer Empfindlichkeitsvergleiche
Fluoreszenz ist eine hochempfindliche analytische Technik, daher ist eine der wichtigsten Spezifikationen bei der Auswahl eines Spektrofluorometers ihre Empfindlichkeit. Die Gesamtempfindlichkeit eines Spektrofluorometers wird durch viele Faktoren bestimmt, darunter, aber sicherlich nicht beschränkt auf, das optische Design, die Kopplungsoptik, die Intensität des gelieferten Anregungslichts, die Effizienz der Fluoreszenzerfassung, das Design des Spektrometers, die Detektortechnologie und vieles mehr. Zum Beispiel garantiert ein System mit einer Lampe mit höherer Wattzahl nicht, dass es insgesamt eine bessere Fluoreszenzempfindlichkeit bietet.
Da so viele Variablen bei der Herstellung eines empfindlichen Fluorometers eine Rolle spielen, wird ein standardisierter Referenztest benötigt, der von jedem Benutzer durchgeführt werden kann, um einen Fluorometer richtig mit einem anderen zu vergleichen.
Früher verwendeten einige kommerzielle Hersteller von Fluorometern Nachweisgrenzen für bestimmte fluoreszierende Moleküle wie Chininsulfat oder Fluorescein, um die Empfindlichkeit nachzuweisen. Heute können jedoch die Fluorometer mit der höchsten Empfindlichkeit bei so niedrigen Konzentrationen von Fluorophoren detektieren, dass die Fähigkeit, eine serielle Verdünnung bis zu diesen Nachweisgrenzen genau durchzuführen, fraglich wird. Daher ist der Wasser-Raman-Test zu einem Industriestandard geworden, als gutes Maß für die relative Empfindlichkeit verschiedener Instrumente. Der Wasser-Raman-Test ist ebenfalls vorzuziehen, da ultrareines Wasser weltweit leicht verfügbar ist, die Probe stabil ist, das Signal relativ schwach ist und das Raman-Band des Wassers über den gesamten Wellenlängenbereich des Instruments gemessen werden kann, was robustere Vergleiche ermöglicht als mit einer einzelnen fluoreszenten Sonde. Diese Empfindlichkeitsspezifikation wird aus einem Emissionsspektrum des Raman-Schwingungsbandes für reines Wasser abgeleitet. Typischerweise wird sie mit der Anregungswellenlänge bei 350 nm erfasst, mit einem Emissionsabtast von 365 bis 450 nm. Im Allgemeinen wird die Empfindlichkeit des Fluorometers in einem Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) angegeben, also einem Vergleich eines Signalwerts in Anwesenheit eines Signals mit einem Wert für Systemrauschen in Abwesenheit von Signal.
Leider verwenden nicht alle Hersteller dieselben experimentellen Bedingungen zur Erfassung dieses Datensatzes, und sie verwenden auch nicht dieselben Formeln zur Berechnung des SNR der erfassten Daten. Es gibt keinen richtigen oder falschen Weg, Daten zu sammeln oder zu analysieren, aber es ist klar, dass verschiedene Methoden und Analysen ganz unterschiedliche Zahlen liefern können. Daher ist es wichtig nicht nur zu wissen, wie das Wasser-Raman-Spektrum erfasst wurde, sondern auch, wie die Daten verarbeitet wurden. Wenn Sie sicherstellen können, dass die Daten auf die gleiche Weise erfasst und analysiert werden, können Sie einen fairen Vergleich zwischen zwei verschiedenen Fluorometern anstellen.
In dieser technischen Anmerkung heben wir die verschiedenen Faktoren hervor, die das Signal-Rausch-Verhältnis beeinflussen, und legen die HORIBA-Methode dar, damit die Forscher über die notwendigen Werkzeuge verfügen, um einen ordnungsgemäßen Vergleich anzustellen.
Seit Jahrzehnten definiert HORIBA das SNR als Differenz des Spitzensignals minus Hintergrundsignal, geteilt durch die Quadratwurzel des Hintergrundsignals. Wir nennen dies die FSD-Methode (First Standard Deviation).
Sie wird auch als Quadratwurzelmethode (SQRT) bezeichnet.
Die FSD-Signal-Rausch-Verhältnis-Formel ist unten dargestellt.
Das Spitzensignal wird bei der Wasser-Raman-Spitzenintensität bei 397 nm (bei 350 nm Anregung) und dem Rauschen in einem Bereich gemessen, in dem kein Raman-Signal vorhanden ist (450 nm). Für ein perfektes optisches System gäbe es bei 450 nm kein Signal, da dort keine Raman-Emission vorhanden ist; jedoch weisen alle elektrooptischen Systeme gewisse Stufen von Streulicht und Rauschen auf, die zu einem Signal bei 450 nm beitragen. Die obige Formel setzt voraus, dass das Rauschen durch Poisson-Statistiken bestimmt wird und daher als Quadratwurzel des Basissignals bei 450 nm berechnet werden kann. Es ist nur für die Photonenzählung anwendbar, daher sollte es zum Vergleich nur beim Vergleich von zwei Photonenzählspektrofluorometern verwendet werden.
Eine weitere häufig verwendete Methode ist die Division der Differenz zwischen Peak-Signal und Hintergrundsignal durch den Root Mean Square (RMS)-Wert des Rauschens auf dem Hintergrundsignal. Diese zweite Methode wird von mehreren Herstellern verwendet und ist der beste Ansatz für Spektrofluorometer, die analoge Detektoren verwenden, wobei die Intensitätseinheiten von Hersteller zu Hersteller variieren.
Die Formel des RMS-Signal-Rausch-Verhältnisses ist unten dargestellt.
Um den RMS-Rauschwert für den Nenner korrekt zu messen, wird ein zweites Experiment durchgeführt, bei dem das Fluorometer bei 350 nm anregt und die Kinetik als Funktion der Zeit bei 450 nm Emission gemessen wird.
Die RMS-Formel ist gegeben durch:
Dabei wird das zeitbasierte Hintergrundsignal n mal gemessen und S ist der durchschnittliche Intensitätswert über den kinetischen Scan.
Nicht alle Unternehmen verwenden die oben beschriebene RMS-Formel. Einige verwenden das Peak-zu-Peak-Rauschen der Daten außerhalb des Peaks, zum Beispiel von 420 bis 450 nm, und wieder andere verwenden eine RMS-Schätzung, entweder aus dem Off-Peak-Bereich des Spektrums oder aus einem sekundären kinetischen Scan des Peaks. Letztlich ist die Methode zur Bestimmung des RMS-Rauschs nicht so kritisch wie die Anwendung exakt derselben Formel auf Vergleiche, die man anstellen würde.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es keine beste Möglichkeit gibt, das Signalrauschverhältnis für das Raman-Band des Wassers zu berechnen, und verschiedene Unternehmen machen dies auf unterschiedliche Weise. Die FSD-Methode ist nur zum Vergleich von Photonenzählspektrofluorometern gültig. Beim Vergleich eines oder mehrerer Systeme, die analoge Erkennung verwenden, sollte RMS oder eine RMS-Schätzungsmethode verwendet werden.
Solange die verschiedenen Datensätze die Sensitivität auf die gleiche Weise berechnen, liefert jede bestimmte Methode ein relatives Maß für das SNR eines Spektrums im Vergleich zu einem anderen.
So wie die Formel zur Berechnung des Signal-Rausch-Verhältnisses einen dramatischen Einfluss auf die scheinbare Empfindlichkeit eines bestimmten spektralen Datensatzes haben kann, haben auch die Hardwarekonfiguration des Instruments und die experimentellen Parameter der Datenerfassung einen dramatischen Einfluss auf die Qualität des aufgenommenen Spektrums.
Es gibt viele Hardwareparameter, Einstellungen und Optionen, die alle Einfluss auf die gemessene Empfindlichkeit eines Spektrofluorometers haben. Dies kann es äußerst schwierig machen, die relative Empfindlichkeit zweier verschiedener Instrumente absolut zu vergleichen, wenn sie nicht nahezu identisch verwendet werden. Im Folgenden besprechen wir jeden dieser Faktoren und deren Auswirkungen auf die resultierenden Daten.
Anregungswellenlänge: Die Anregungswellenlänge sollte für alle zu vergleichenden Systeme identisch sein. Die HORIBA-Methode verwendet eine 350-nm-Anregung für das Raman-Band des Wassers, wie es die meisten anderen Hersteller tun. Bei Anregung bei 350 nm erreicht das Raman-Emissionsband für Wasser einen Höhepunkt bei 397 nm.
Es ist ein Glück, dass die meisten Hersteller auf diese Anregungswellenlänge standardisiert haben, da dies einen besseren Vergleich ermöglicht. Es ist jedoch völlig legitim, die Anregungswellenlänge auf einen anderen Wert zu verschieben, um die Empfindlichkeit in einem anderen Wellenlängenbereich (z. B. NIR) zu testen.
Emissionsabtastreichweite: Die HORIBA-Methode scannt den Emissionsmonochromator von 365 bis 450 nm mit 0,5 nm-Schritten, um den gesamten Raman-Peak bei 397 nm und auch den Hintergrund bei 450 nm zu erfassen.
Bandbreite (Spaltgröße): Die HORIBA-Methode verwendet 5-nm-Bandpass-Schlitze sowohl auf dem Anregungs- als auch auf dem Emissionsspektrometer. Einige Hersteller spezifizieren 10-nm-Schlitze, was die Empfindlichkeit im Vergleich zu 5 nm erhöht. Es wurde berichtet, dass die Verdopplung der physikalischen Spaltgröße am Ein- und Austritt eines Monochromators die Intensität der Anregung und des Emissionsnachweisdurchsatzes vervierfachen kann, da der Durchsatz als Quadrat der Größenzuwachs verläuft, aber dies ist eine vereinfachte Schätzung, die empirisch gemessen werden sollte. HORIBA hat den Faktorunterschied mit dem HORIBA Fluoromax gemessen und beobachtet, dass bei Fluoromax die Verdopplung der Schlitzgröße von 5 auf 10 nm das Gesamt-Signal-Rausch-Verhältnis für das Raman-Band des Wassers um mehr als das Dreifache erhöht. Das ist jedoch bei allen Fluorometern unterschiedlich, also vergleiche bitte unbedingt mit identischen Bandpässen.
Integrationszeit (oder Reaktionszeit): Dies bezieht sich darauf, wie lange der Detektor ein Signal an einer gegebenen Wellenlängen-Stufenposition aufnehmen darf. Es spielt auch eine bedeutende Rolle bei der Gesamtempfindlichkeit eines Fluorometers. Die HORIBA-Methode verwendet an jedem Wellenlängenpunkt eine Integrationszeit von 1 Sekunde, ähnlich wie bei anderen Herstellern. Einige Hersteller geben jedoch eine Antwortzeit von 2 Sekunden an, die das Gesamtsignal-Rausch-Verhältnis fast um den Faktor 2 erhöht. Wenn Sie Produkte vergleichen, achten Sie darauf, die gleiche Integrationszeit (Antwortzeit) zu verwenden.
PMT-Typ: Die meisten Spektrofluorometer verwenden ein Photomultiplierrohr (PMT) als ihren einzigen Detektor für Fluoreszenzausstrahlung, ohne Möglichkeit, das Detektorgehäuse zu ändern. Das gilt für die meisten analytischen Labor-Fluorometer. Einige dieser Tischsysteme ermöglichen die Auswahl verschiedener individueller PMTs mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen und Spezifikationen. PMTs, die nicht so weit in das NIR hinein nachweisen wie andere PMTs, haben eine geringere Dunkelzählrate, sodass sie im Bereich von 350 bis 400 nm ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis liefern, allerdings sind sie möglicherweise nicht im gesamten Emissionswellenlängenbereich, der für ein bestimmtes Labor gewünscht wird, nutzbar. Der Standard-PMT von HORIBA, der in den FluoroMax Plus, Fluorolog3- und QuantaMaster 8000-Serien verwendet wird, ist der Hamamatsu R928P PMT, der als Industriestandard für Fluormetrie gilt. In solchen Fällen sollte man sicherstellen, dass jedes Fluorometer denselben PMT verwendet, wenn möglich.
Optische Filter: Ein optischer Filter kann dem optischen Weg eines Fluorometers hinzugefügt werden, entweder auf der Anregungs- oder Emissionsseite der Probe. Diese können manuell in einen Filterhalter im Probenfach gelegt werden oder Teil eines Filterrads sein, das automatisch verschiedene Filter in den optischen Pfad einsetzt, wenn verschiedene experimentelle Protokolle ausgewählt werden. Optische Filter haben die Wirkung, die Streulichtabstoßung bei bestimmten Wellenlängen zu verbessern, und sie können das Signal-Rausch-Verhältnis eines Fluorometers dramatisch verbessern. HORIBA verwendet keine optischen Filter außer den Rasterspektrometern selbst, wenn er das SNR für Wasser-Raman mit den Spezifikationen der Fluoromax-, Fluorolog3- oder QuantaMaster 8000-Serie spezifiziert. Beim Vergleich eines HORIBA Fluorometers mit einem Fluorometer, das automatisierte Filter verwendet, verwenden Sie bitte keinen Filter oder, falls das Gerät automatisch Filter anwendet, überprüfen Sie, welche Marke und Art von Filtern verwendet werden und wann sie verwendet werden, um eine ähnliche experimentelle Methode mit einem HORIBA Fluorometer zu replizieren.
Detektortyp: Modulare Forschungsfluorometer enthalten typischerweise ein PMT-Gehäuse als Standard, ermöglichen aber viele verschiedene Arten von Einkanaldetektoren, um den Wellenlängenbereich oder die Fluoreszenzlebensdauer eines Instruments zu verlängern. Alternative Detektoren umfassen gekühlte PMT-Gehäuse, verschiedene Festkörperdetektoren wie InGaAs, MCP-PMTs und so weiter. Diese verschiedenen Detektortypen haben dramatische Auswirkungen auf das Signal-Rausch-Verhältnis jeder einzelnen Probenmessung, daher sollte man auch hier beim Vergleich der Empfindlichkeit eines Fluorometers mit einem anderen sicherstellen, dass derselbe Detektortyp für die Datenerfassung beider Systeme verwendet wird.
Detektortemperatur: Die meisten kommerziellen Spektrofluorometer verwenden PMT-Gehäuse, die nicht gekühlt sind, und tatsächlich bieten viele Geräte nicht einmal eine gekühlte Detektoroption an. Ein gekühltes PMT-Gehäuse kann die Empfindlichkeit eines Instruments verbessern, indem es die Dunkelzählrate (Hintergrund) im Vergleich zum exakt gleichen PMT in einem Umgebungsgehäuse reduziert. Die Standard-PMT-Gehäuse von HORIBA im FluoroMaxPlus, Fluorolog3 und QuantaMaster 8000 sind Ambient-PMT-Gehäuse, jedoch bieten die Fluorolog3- und QuantaMaster 8000-Serie optionale gekühlte PMT-Gehäuse zur Verbesserung der Empfindlichkeit und NIR-Erkennung an. Beim Vergleich modularer Forschungsfluorometer sollten Sie unbedingt die Daten vergleichen, die mit demselben PMT-Gehäuse (Umgebungs- oder gekühltem) gesammelt wurden und, wenn sie gekühlt sind, ebenfalls auf dieselbe Temperatur abgekühlt werden.
Einzel- versus Doppelmonochromator: Modulare Forschungsfluorometer ermöglichen es einem Forscher, Einzel- oder Doppelmonochromatoren entweder auf dem Anregungs- oder dem Emissionsoptischen Pfad auszuwählen. Hier bezeichnet der Begriff Doppelmonochromator zwei dispersive Gitterstufen, nacheinander, mit einem Eingangsschlitz, einem Zwischenschlitz und einem Austrittsschlitz. Ein Doppelmonochromator kann entweder additiv oder dispersiv konfiguriert werden, aber in beiden Fällen unterscheiden sich der Durchsatz und die Streulichteigenschaften eines einzelnen im Vergleich zu einem Doppelmonochromator stark und haben einen großen Einfluss auf das SNR eines Wasser-Raman-Scans, selbst wenn Bandbreiten, Integrationszeiten und Wellenlängen konstant gehalten werden.
Rillendichte des Gitters: Die Rillendichte eines Gitters beeinflusst ebenfalls den Durchsatz und damit die Empfindlichkeit eines Spektrofluorometers. Bei den meisten Spektrofluorometern ist das kein großes Problem, da die Systeme nur mit einem bestimmten Gitter hergestellt werden. In diesem Fall ist das Wichtigste, sicherzustellen, dass die Bandpässe gleich ausgewählt werden. Bei modularen Fluorometern kann man die Monochromatoren jedoch mit verschiedenen oder mehreren Gittern konfigurieren. Bei diesen Systemen müssen Sie sehr darauf achten, die Dinge so ähnlich wie möglich zu halten. Wenn man zum Beispiel zwei Instrumente mit ähnlichen Brennweitenspektrometern hat, erhöht oder verringert die Änderung der Rillendichte des Gitters die Empfindlichkeit für dieselbe 5-nm-Bandpasseinstellung. Das HORIBA-Verfahren verwendet Gitter mit einer Rillendichte von 1.200 Rillen pro Millimeter.
Flammenwinkel des Gitters: Die für einen Anregungs- oder Emissionsmonochromator ausgewählten Gitter bieten einen optimalen Durchsatz in einem bestimmten Wellenlängenband, dem sogenannten Blaze-Winkel, da dieser durch den Winkel der Gitter-Gravierung auf der Gitteroberfläche bestimmt wird. Daher wäre ein Anregungsmonochromator mit einem 350 nm Blazed-Anregungsmonochromator und einem 400 nm Emissionsmonochromator die optimale Wahl, um bei Anregung bei 350 nm die beste Wasser-Raman-Empfindlichkeit zu erreichen. Da die meisten Fluorometer keine Einstellung des Gitters erlauben, spielt diese Variable keine Rolle, aber bei denen, die es erlauben, Gitter auszuwählen, sollten Sie unbedingt Gitter mit demselben oder sehr ähnlichen Leuchtwinkel wählen, um einen gültigen Vergleich anzustellen.
Die experimentellen Bedingungen für den Ultrareinwasser-Raman-Emissionsscan waren wie folgt.
QuantaMaster QM-8075-11 Spektrofluorometer (75-Watt-Xenonlampe, Einzelanregung und Einzelemissionsmonochromator) mit optionalem gekühltem PMT-Gehäuse.
Die experimentellen Ergebnisse finden Sie unten.
Beachten Sie, dass dieses spezielle Ergebnis die HORIBA Mindestwasser-Raman-FSD-Spezifikation für das QM-8075-11-Spektrofluorometer übersteigt, wenn es mit einem optionalen gekühlten R928 PMT ausgestattet ist, der derzeit mit > 30.000:1 (FSD-Methode) angegeben ist.
Wasser Raman FSD-Ergebnisse
Obwohl darauf geachtet werden muss, dass sowohl experimentelle Bedingungen als auch mathematische Formeln konsequent angewendet werden, ist das Wasser-Raman-Signal-Rausch-Verhältnis ein guter Bestimmungsfaktor für die relative Empfindlichkeit eines Fluorometers im Vergleich zu einem anderen.
Beim Vergleich von Photonenzähl-Spektrofluorometern wird die FSD-(SQRT)-Methode bevorzugt.
HORIBA blickt auf eine jahrzehntelange Tradition der Exzellenz in der Fluoreszenzfertigung zurück, und wir zeigen gerne genau die Bedingungen, unter denen wir unsere branchenführenden Empfindlichkeitsanforderungen erreichen.
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