Grundlagen und Theorie der Fluoreszenzspektroskopie

Fluoreszenz ist eine Art von Lumineszenz, die durch Photonen verursacht wird, die ein Molekül anregen und es in einen elektronisch angeregten Zustand bringen. Sie entsteht durch die Absorption von Photonen im Singlet-Grundzustand, die zu einem Singlet-angeregten Zustand befördert werden. Wenn das angeregte Molekül in den Grundzustand zurückkehrt, emittiert es ein Photon mit geringerer Energie, was einer längeren Wellenlänge entspricht als das absorbierte Photon.

Die Fluoreszenzspektroskopie analysiert die Fluoreszenz eines Moleküls anhand seiner fluoreszenten Eigenschaften. Fluoreszenz ist eine Art von Lumineszenz, die durch Photonen verursacht wird, die ein Molekül anregen und es in einen elektronisch angeregten Zustand bringen.

Abb. 3 zeigt das Jablonski-Diagramm (Jablonski, 1933), ein Schema des Übergangs des elektronischen Zustands eines Moleküls während des Fluoreszenzphänomens. Die linke Achse zeigt zunehmende Energie, während ein typisches fluoreszierendes Molekül ein Absorptionsspektrum besitzt. Dieses Spektrum zeigt die Energie oder Wellenlängen, in denen das Molekül Licht absorbiert.

Einfach ausgedrückt ist die Fluoreszenzlebensdauer eines Moleküls die durchschnittliche Zeit, die es im angeregten Zustand verbringt. Dies hängt vom Molekültyp und seiner lokalen Umgebung ab. Typischerweise fällt der angeregte Zustand exponentiell ab, wie in der untenstehenden Gleichung angegeben. Die Verwendung der Fluoreszenzlebensdauer hat Vorteile gegenüber einer Intensitätsmessung, da es sich um eine "absolute" Messung handelt und nicht um die "relative" stationäre Messung (die ein zeitlich gemitteltes Signal liefert).

I(t) = I₀ exp^(-t/τ)

τ ist die Fluoreszenzlebensdauer oder die Zeit, in der die Intensität auf 1/e ihres Anfangswerts abfällt.

Wenn mehr als ein angeregter Zustand vorhanden ist, manchmal weil die untersuchte Probe eine Mischung fluoreszierender Moleküle enthält und es unterschiedliche lokale Umgebungen gibt oder ein Molekül eine Transformation durchläuft, die zu unterschiedlichen angeregten Zustandspezies führt, wird der Zerfall voraussichtlich komplexer sein. Es kann einen exponentiellen Abfall pro angeregtem Zustand geben. Dies kann durch eine Summe von Exponentialzahlen dargestellt werden (siehe unten), wobei α (der präexponentielle Faktor) die relative Konzentration jedes t-Zerfalls zum beobachteten Gesamtabfall angibt.

Um Messungen zu vergleichen, ist es oft nützlich, die präexponentiellen Faktoren in irgendeiner Weise zu normalisieren. Wenn ein Vergleich der Konzentration jeder fluoreszierenden Spezies erforderlich ist, kann das normalisierte α verwendet werden. Wenn ein Vergleich des Beitrags zum stationären Spektrum (Gesamtfluoreszenzemission) erforderlich ist, kann die fraktionelle oder relative Amplitude (in %) verwendet werden. Letzterer ist der präexponentielle Faktor, gewichtet nach der Lebensdauer.

Manchmal kann es ebenso akzeptabel sein, einen komplexen Zerfall über eine durchschnittliche Lebensdauer darzustellen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass dies am besten durch eine korrekte Modellierung des komplexen Zerfalls geschieht, anstatt nur zu versuchen, einen einzelnen exponentiellen Zerfall daran anzupassen. In den meisten Fällen ist die Verwendung der durchschnittlichen Amplitudenlebensdauer angemessen, jedoch ist es bei Abschreckungsexperimenten korrekter, die durchschnittliche Fluoreszenzlebensdauer der Intensität zu verwenden. Es gibt veröffentlichte Arbeiten, die sich mit den relativen Vorzügen dieser Durchschnitte beschäftigen. (Lakowicz, 2006) (Berezin, 2010)

Phosphoreszenz ist ein Prozess, bei dem das Photon nicht aus einem Singlet-angeregten Zustand, sondern aus einem verbotenen Triplet-Zustand emittiert wird. Die Zeitskala der Emission liegt im Allgemeinen im Bereich von Pikosekunden bis Nanosekunden, während Phosphoreszenz typischerweise Fluoreszenzmikrosekunden, Millisekunden oder sogar länger anhält... Minuten oder Stunden. Forscher verwenden typischerweise eine gepulste Quelle wie eine Blitzlampe oder LED, um Phosphoreszenzspektren und Zerfall auf diesen längeren Zeitskalen zu messen. Phosphoreszenzmessungen verwenden eine länger lebende gepulste Quelle, wie zum Beispiel eine Xenon-Blitzlampe. Das Timing der blinkenden Lampe kann verwendet werden, um Spektren bei unterschiedlichen Phosphoreszenzlebensdauern zu messen.

Phosphoreszenzmessungen verwenden eine länger lebende gepulste Quelle, wie zum Beispiel eine Xenon-Blitzlampe. Das Timing der blinkenden Lampe kann verwendet werden, um Spektren bei unterschiedlichen Phosphoreszenzlebensdauern zu messen.