Stationäre Fluoreszenztechniken

Da die Fluoreszenzintensität von der Konzentration des fluoreszierenden Moleküls abhängt, können standardmäßige Konzentrationskurben leicht erzeugt und verwendet werden, um die Konzentrationen desselben Moleküls in unbekannten Proben zu bestimmen.

Dies ist nützlich in Abschreckungsexperimenten, bei denen Zusätze die Intensität der Fluorophore systematisch verringern. Konzentrationskurven können auch erstellt werden, um zu untersuchen, wie andere Moleküle mit Dingen wie Proteinen interagieren, und können systematisch Proteinstrukturänderungen, Faltung, Entfaltung, Assoziation und Dissoziation nachverfolgen.

Als Beispiel für ein Einzelpunkt-Fluoreszenzexperiment ist hier eine Kalibrierungskurve eines bekannten Satzes fluoreszierender Mikrosphären. Fünf bekannte Konzentrationslösungen wurden verwendet, um die Standardkurve zu erstellen. Die Kurve wurde auf ein lineares Polynom angepasst, und die Anpassung wurde verwendet, um die Konzentration von Perlen in einer unbekannten Lösung zu berechnen.

Die Temperatur hat tatsächlich Einfluss auf die Fluoreszenzintensität und manchmal auch auf die spektrale Wellenlänge und -form. Der molare Extinktionskoeffizient (oder Strahlungsgeschwindigkeitskonstante) eines Fluoreszenzemitters hängt in der Regel nur schwach von der Temperatur ab. Allerdings wird die nicht-strahlende Geschwindigkeitskonstante, die durch Schwingungskopplung gesteuert wird, stark beeinflusst und steigt mit steigender Temperatur. Das bedeutet, dass die Fluoreszenz im Allgemeinen mit steigender Temperatur abnimmt. Ebenso nimmt das Kollisionsabschrecken mit der Temperatur zu, wodurch auch die Fluoreszenzintensität abnimmt.

Die Fluoreszenz wird stark von den Molekülen um das emittierende Molekül herum beeinflusst. Außerdem zeigen Fluorophore, die bei sehr niedrigen Temperaturen mit flüssigem Stickstoff oder flüssigem Helium gemessen werden, eine erhöhte Fluoreszenz sowie eine erhöhte Menge an Schwingungsstrukturen in den Anregungs- und Emissionsspektren. Das Kollisionsabschrecken nimmt ab und auch die nicht-strahlende Geschwindigkeitskonstante nimmt ab, was die Fluoreszenzemissionsintensität erhöht.

Moleküle wie polyaromatische Kohlenwasserstoffe (z. B. Anthracen, Naphthalin, Pyren, Perylen usw.) haben Schwingungsspitzen, die bei Raumtemperatur im Spektrum auftreten. Bei einer flüssigen Stickstofftemperatur von 77 K werden diese Fluoreszenzspitzen strukturierter und Phosphoreszenzspitzen messbar. Diese unten wurden sowohl bei 298 K als auch bei 77 K in einem Dewar-Probezubehör für flüssigen Stickstoff gemessen.

Raman-Peaks treten oft in einem Fluoreszenzspektrum auf, besonders wenn die Fluoreszenzintensität schwach ist. Um einen Raman-Peak zu entfernen, kann das Spektrum eines Blanklösungsmittels unter denselben Bedingungen wie das der Probe gemessen werden, wobei dieses "Blank"-Spektrum vom fluoreszierenden Probenspektrum abgezogen wird. Da ein Raman-Peak ein Schwingungsphänomen ist, das mit der Energie des Anregungslichts zusammenhängt, kann die Position teilweise kontrolliert werden. Ein Raman-Peak bewegt sich näher oder weiter von der Anregungswellenlänge, wenn die Anregung stärker ins blaue bzw. rote Gebiet bewegt wird. Wenn also ein Raman-Peak mit einem Fluoreszenzspektrum der Probe stört, kann die Anregungswellenlänge so verlegt werden, dass der Raman-Peak bei Bedarf an einem etwas anderen Ort platziert wird.

Fluoreszenzspektren können auch verwendet werden, um Veränderungen im Falten oder Entfalten von Proteinen zu verfolgen. Dies ist ein Beispiel dafür, wie das Fluoreszenzspektrum von Tryptophan in einer Lösung von 1 μM BSA mit steigender Temperatur aussieht. Diese Kurven stellen die Temperatur von 5 bis 70 °C dar. Man sieht auch, wie die Intensität abnimmt und das Spektrum sich mit steigender Temperatur auf kürzere Wellenlängen verschiebt. Anisotropie oder zeitaufgelöste Anisotropie könnte ebenfalls verwendet werden, um Informationen über Größe, Form und Orientierungsbewegung des Proteins zu gewinnen.