Eine typische Anregungsemissionsmatrix (EEM)
Eine Messung, die im Bereich der Fluoreszenzspektroskopie immer weiterverwendet wird, ist die Anregungsemissionsmatrix, kurz EEM. Ein EEM ist ein 3D-Scan, der zu einem Konturdiagramm der Anregungswellenlänge versus Emissionswellenlänge versus Fluoreszenzintensität führt. EEMs werden für verschiedene Anwendungen eingesetzt, bei denen eine Mehrkomponentenanalyse erforderlich ist, und werden oft als Molekularfingerabdruck für viele verschiedene Probentypen bezeichnet.
Einige der ersten veröffentlichten Anwendungen der EEM-Spektroskopie erfolgten in den 1980er Jahren, als die Technik zur Untersuchung der Tryptophanfluoreszenz in Lipoproteinen niedriger Dichte im menschlichen Blutserum (Koller, 1986) und zur Untersuchung fluoreszierender Komponenten im menschlichen Plasma von Tumorpatienten (Leiner, 1986) eingesetzt wurde.
Traditionelle Scanning-Fluorometer ermöglichen aufgrund von drei grundlegenden Einschränkungen nicht die volle Leistung der molekularen EEM-Identifikation. Erstens können herkömmliche Rasterspektrofluorometer nicht von Natur aus die unterschiedlichen Probenkonzentrationen fluoreszierender Moleküle kompensieren. Der innere Filtereffekt (IFE) ist ein bekanntes Phänomen, das das gemessene Fluoreszenzspektrum eines Moleküls aufgrund von Absorption bei höheren Probenkonzentrationen (typischerweise über 0,1 bis 0,2 Absorptionseinheiten) verzerrt. Die einzige Möglichkeit, IFE mit einem herkömmlichen Fluorometer zu korrigieren, besteht darin, eine sekundäre Messung auf einem anderen Absorptionsspektrometer zu erfassen und das gemessene Fluoreszenzsignal entsprechend anzupassen. Auch das ist jedoch sehr knifflig, da die Messung nicht gleichzeitig und mit exakt denselben Volumina stattfindet. Daher fehlt es traditionellen Scanning-Fluorometern an echter Konzentrationsunabhängigkeit, was die Fähigkeit eines herkömmlichen EEM stark einschränkt, viele Proben genau zu identifizieren.
Zweitens, da Fluorometer per Definition Fluoreszenz messen, fehlen ihnen wichtige Absorptions- und Farbinformationen für alle nicht-fluoreszierenden Moleküle, was ein entscheidender Bestandteil einer umfassenden multikomponentigen molekularen Identifikation sein kann.
Eine aktuelle Entwicklung, die Erfassung von simultaner Absorption, Transmission und Fluoreszenz-EEMs (A-TEEM), ist auf zwei HORIBA Spektrofluorometern verfügbar und löst viele der oben genannten Probleme, während der Effekt des inneren Filters spontan korrigiert wird. Da die Messungen gleichzeitig durchgeführt werden, existieren keine Konzentrationsschwankungen.
Schließlich sind Einzelkanal-Scan-Geräte sehr langsam und benötigen mehrere Minuten bis eine Stunde, um einen gesamten Datensatz zu sammeln. Daher sind Scanning-Fluorometer darauf beschränkt, wie viele EEM-Daten sie an einem Tag sammeln können, und arbeiten auch nur mit Proben, die sich während der EEM-Aufnahmezeit nicht ändern.
Die Genauigkeit der EEM-Fluoreszenz ohne IFE-Korrektur ist auf Proben beschränkt, deren Konzentrationen nur bei Absorptionswerten unter etwa 0,1–0,2 liegen. Um die wahre Leistung von Fluoreszenz-EEMs zu nutzen, benötigt man multivariate Softwaremethoden wie Principal Components Analysis (PCA), Classical Least Squared (CLS) und Parallel Factor Analysis (PARAFAC).
Der innere Filtereffekt
Der innere Filtereffekt besteht aus zwei Prozessen: dem Primärfiltereffekt (PIF), bei dem die Intensität des Anregungslichts durch Absorption als Funktion der optischen Weglänge der Flüssigkeitsprobe vor Erreichen des fluoreszierenden Volumens allmählich abnimmt, und dem Sekundärfiltereffekt (SIF), bei dem die emittierte Fluoreszenzintensität durch Reabsorption sogar durch den Teil der Probe gemindert wird, der nicht direkt vom Anregungsstrahl angeregt wird.
Spektrale Konsequenz des inneren Filtereffekts
EEMs werden immer häufiger zur Qualitätsanalyse von Wasser eingesetzt, insbesondere zur Untersuchung chromophorischer gelöster organischer Substanz, auch CDOM genannt. Gelöste organische Substanz umfasst Aminosäuren, Huminsäuren, Fulvicsäuren und andere Beispiele für zerrottete Substanzen in natürlichen Wasserquellen oder Desinfektionsprodukte bei Wasseraufbereitungsprozessen.
EEMs werden verwendet, um das Vorkommen jedes einzelnen bei sehr niedrigen Konzentrationen zu identifizieren, typischerweise im ppb-Bereich. Die Instrumentierung für diese Anwendung misst idealerweise sowohl Fluoreszenzspektren als auch Absorption gleichzeitig.
Da die Fluoreszenz linear ist und nur bei Absorptionswerten kleiner als etwa 0,1–0,2 konzentriert, müssen Proben mit höherer Absorption Korrekturen zur Fluoreszenzintensität für Effekte des inneren Filters durch Messung und Anwendung des UV-sichtbaren Absorptionsspektrums verwenden.
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