Was ist Fluoreszenzanisotropie oder Fluoreszenzpolarisation?

Fluoreszenzanisotropie oder Fluoreszenzpolarisation ist eine Messung der sich ändernden Ausrichtung eines Moleküls im Raum in Bezug auf die Zeit zwischen Absorptions- und Emissionsereignissen. Absorption und Emission geben die räumliche Ausrichtung der Dipole des Moleküls relativ zum elektrischen Vektor der elektromagnetischen Anregungswelle bzw. des emittierten Lichts an. Mit anderen Worten: Wenn die Fluorophorpopulation mit vertikal polarisiertem Licht angeregt wird, behält das emittierte Licht einen Teil dieser Polarisation, je nachdem, wie schnell es in Lösung rotiert. Je schneller die Ausrichtungsbewegung, desto stärker wird das ausgestrahlte Licht depolarisiert. Je langsamer die Bewegung, desto mehr behält das emittierte Licht die Polarisation.

Um diese Informationen zu nutzen, werden Polarisationssensoren im Anregungslichtweg und im Emissionslichtweg eines Fluorometers platziert. Die Anisotropie wird berechnet, indem das Verhältnis der Intensitäten in der obigen Gleichung genommen wird, wobei IVV die Intensität mit vertikal polarisierter Anregung und vertikaler Polarisation auf der detektierten Emission angibt. IVH zeigt die Intensität an, wenn ein vertikaler Polarisationssensor auf der Anregung und ein horizontaler Polarisator auf der Emission verwendet wird. G ist ein Gitterfaktor, der als Korrektur für die differentielle Übertragung der beiden orthogonalen Vektororientierungen des Instruments verwendet wird.

Wie funktioniert das Experiment? Zuerst wird die Fluoreszenz gemessen, wobei der Anregungspolarisator vertikal eingestellt und der Emissionspolarisator ebenfalls vertikal eingestellt ist. Die Intensität wird als IVV in die Anisotropiegleichung eingebettet. Anschließend wird die Messung wiederholt, wobei der Emissionspolarisator horizontal ausgerichtet ist und die Intensität für als IVH in die Gleichung aufgenommen wird.

Die Anisotropieformel enthält einen Faktor 2, da es zwei orthogonale Orientierungen gibt, auf die die Ablenkung vom VVz-Vektor projiziert werden kann, Hx und Hy, was zu zwei IVH-Komponenten führt.

Ein verwandter Ausdruck, der Grad der Polarisation p, wird oft verwendet, um einen zweidimensionalen Polarisationsparameter zu beschreiben, bei dem nur eine horizontale Komponente berücksichtigt wird. In letzterem Fall fehlt der Multiplikator 2 für IVH, wobei p die Stelle von r einnimmt.

Als nächstes wird der G-Faktor berechnet, indem die Intensität bei HH und HV gemessen wird... und die Einfügung von IHV und IHH in die Gleichung für G. Anisotropie, bezeichnet durch das kleine "r", wird oft als Indikator für Molekülgröße, Diffusion und Viskosität verwendet.

Hier sind einige Gleichungen, die zur Analyse von Anisotropieergebnissen nützlich sind. Die grundlegende Anisotropiegleichung wurde bereits diskutiert, aber sie kann für vollständige Fluoreszenzzerfälle berechnet werden, was eine zeitaufgelöste Anisotropie ergibt. Aus zeitaufgelöster Anisotropie kann man Reorientierungszeitkonstanten erhalten und dann die Perrin-Gleichung und die Stokes-Einstein-Debye-Gleichung verwenden, um Eigenschaften wie Diffusionskoeffizienten, lokale Viskosität und Molekülvolumen abzuschätzen.

Diese entsprechen sehr wichtigen Informationen bei Anwendungen wie Protein- oder Molekularbindungen, Polymeraggregation und anderen lokalen Umweltstudien in komplexen Lösungen und Materialien.

Als Beispiel kann man das temperaturabhängige Protein-Entfaltungsverhalten von BSA deutlich erkennen, gemessen durch Fluoreszenzanisotropie. In diesem Fall wird die Anisotropie der intrinsischen Tryptophanreste verwendet.

Fluoreszenzkinetik bezeichnet die Beobachtung der Fluoreszenzintensität über die Zeit. Hier wird eine Probe bei einer einzigen Wellenlänge angeregt und die Emission wird über die Zeit bei einer einzigen Wellenlänge detektiert. Manchmal werden Wellenlängenpaare für ratiometrische Farbstoffe verwendet oder um gleichzeitig Basis- oder Hintergrundinformationen aufzuzeichnen.

Reaktionsraten können mittels zeitbasierter Messungen verfolgt werden, wie Sie hier sehen können. In diesem Beispiel werden die Reaktionsraten der Bindung von Thiamin und Quecksilber zur Bildung von Thiachrom durch Variation der verwendeten Thiaminkonzentration ermittelt. Jeder kinetische Scan stellt eine unterschiedliche Reaktionsrate der Thiachrom-Formationsreaktion dar.

Fluoreszenzkinetik wird oft mit einem schnellen Mischzubehör gemessen, dem sogenannten gestoppten Durchfluss. Der gestoppte Fluss mischt zwei oder mehr Lösungen im Bereich von wenigen Millisekunden zusammen, sodass die Bindung oder Reaktion näher an der Mischungszeit null aufgezeichnet werden kann, ohne die Auswirkungen der Diffusion.

Hier wird die Bindung eines Fluorophors namens ANS an ein Protein, BSA, gezeigt. Die ANS-Fluoreszenz nimmt bei der Bindung zu, sodass die Bindungsrate mittels Fluoreszenzkinetik gemessen werden kann. In diesem Beispiel erfolgt die Bindung von ANS an BSA mit einer Rate von etwa 400 Millisekunden.

Umlaufbäder und Peltier-Temperaturregler sind zwei Zubehörteile, die die Temperatur einer Probe auf einem Fluorometer steuern. "Standard"-Cuvette-Halter bei Fluorometersystemen haben zwei Anschlüsse, um eine Flüssigkeitszirkulation zu ermöglichen, die an ein zirkulierendes Wasserbad angeschlossen werden kann. Dadurch können Temperaturen im Bereich von -40°C bis 70°C reguliert werden.

Eine alternative Methode ist die Verwendung eines von Peltier gesteuerten Zellhalters, der schneller anspricht als ein Wasserbad und die Temperaturregelung im Bereich von -25°C bis 105°C ermöglicht. Der Unterschied besteht darin, dass ein Peltier-Gerät die Temperatur viel präziser steuert als eine Zirkulationscharge, die dazu neigt, eine bestimmte Temperatur zu erreichen, diese zu überschreiten und zurückzukommen, bis die Temperatur erreicht ist.

Umlaufbäder sind gut, wenn während eines Experiments eine Temperatur eingestellt und gehalten werden muss, aber für die Messung von Proben bei unterschiedlichen Temperaturen über einen bestimmten Bereich oder für Proben, die sehr empfindlich auf Temperaturänderungen reagieren, ist ein Peltier-Temperaturregler eine praktischere Wahl. Es ist auch möglich, Kryostaten und Montagekits zu verwenden, die für verschiedene Modelle von Flüssigstickstoff- und Heliumkryostaten erhältlich sind. Neben der Kühlung können die meisten Kryostaten auch Proben auf 500K oder mehr erhitzen.