Die Fluoreszenzspektroskopie ist eine Untersuchungsmethode, die auf den Fluoreszenzeigenschaften der untersuchten Probe basiert und für quantitative Messungen chemischer Produkte verwendet wird.
Die Fluoreszenzspektroskopie analysiert die Fluoreszenz eines Moleküls anhand seiner fluoreszenten Eigenschaften.
Fluoreszenz ist eine Art von Lumineszenz, die durch Photonen verursacht wird, die ein Molekül anregen und es in einen elektronisch angeregten Zustand versetzen.
Die Fluoreszenzspektroskopie verwendet einen Lichtstrahl, der die Elektronen in Molekülen bestimmter Verbindungen anregt und sie Licht emittieren lässt. Dieses Licht wird zu einem Filter und auf einen Detektor geleitet, um das Molekül oder Veränderungen im Molekül zu messen und zu identifizieren.
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Der Begriff Fluoreszenz bezieht sich auf eine Art von Lumineszenz. Lumineszenz, weit gefasst, ist die Lichtemission eines Moleküls. Es gibt verschiedene Arten von Lumineszenz.
Photolumineszenz liegt vor, wenn Lichtenergie oder Photonen die Emission eines Photons stimulieren.
Chemilumineszenz ist definiert als die Phase, in der chemische Energie die Emission eines Photons stimuliert, und dazu gehört auch Biolumineszenz, wie sie bei Glühwürmchen und vielen Meereslebewesen zu beobachten ist.
Elektrolumineszenz ist, wenn elektrische Energie oder ein starkes elektrisches Feld die Emission eines Photons stimuliert, wie zum Beispiel in einigen Lichtanwendungen.
Fluoreszenz ist speziell eine Art der Photolumineszenz, bei der Licht ein Elektron in einen angeregten Zustand erhebt. Der angeregte Zustand erleidet durch Schwingungen einen schnellen thermischen Energieverlust an die Umwelt, und dann wird ein Photon aus dem am niedrigsten gelegenen Singlet-angeregten Zustand emittiert. Dieser Prozess der Photonenemission konkurriert mit anderen nicht-strahlungsfähigen Prozessen, darunter Energietransfer und Wärmeverlust.
Wenn der Begriff "Fluoreszenz" verwendet wird, können dieselben Messmethoden typischerweise auf jede der oben genannten Lumineszenzkategorien angewendet werden.
Die Emissions- und Anregungsspektren eines gegebenen Fluorophors sind Spiegelbilder voneinander
Stationäre Fluoreszenzspektren sind Moleküle, die von einer konstanten Lichtquelle angeregt werden, Fluoreszenz emittieren, und die emittierten Photonen, also die Intensität, werden als Funktion der Wellenlänge detektiert. Ein Fluoreszenzemissionsspektrum ist, wenn die Anregungswellenlänge festgelegt ist und die Emissionswellenlänge abgetastet wird, um ein Diagramm von Intensität versus Emissionswellenlänge zu erhalten.
Ein Fluoreszenz-Anregungsspektrum ist, wenn die Emissionswellenlänge festgelegt ist und die Wellenlänge des Anregungsmonochromators abgescannt wird. Auf diese Weise liefert das Spektrum Informationen über die Wellenlängen, bei denen eine Probe absorbiert, um bei der gewählten einzelnen Emissionswellenlänge zu emittieren. Es ist analog zum Absorptionsspektrum, ist jedoch eine viel sensiblere Technik hinsichtlich Nachweisgrenzen und molekularer Spezifität. Anregungsspektren sind spezifisch für eine einzelne emittierende Wellenlänge/Spezies, im Gegensatz zu einem Absorptionsspektrum, das alle absorbierenden Spezies in einer Lösung oder Probe misst. Die Emissions- und Anregungsspektren eines gegebenen Fluorophors sind Spiegelbilder voneinander. Typischerweise tritt das Emissionsspektrum bei höheren Wellenlängen (geringere Energie) als das Anregungs- oder Absorptionsspektrum auf.
Diese beiden Spektraltypen (Emission und Anregung) werden verwendet, um zu beobachten, wie sich eine Probe verändert. Die spektrale Intensität und/oder die Spitzenwellenlänge können sich je nach Temperatur, Konzentration oder Wechselwirkungen mit anderen Molekülen um sie herum verändern. Dazu gehören Quencher-Moleküle sowie Moleküle oder Materialien, die einen Energietransfer erfordern. Einige Fluorophore sind auch empfindlich gegenüber Eigenschaften der Lösungsmittelumgebung wie pH-Wert, Polarität und bestimmten Ionenkonzentrationen.
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Fluoreszenzemissionsspektren einiger gängiger Fluorophore im UV- und sichtbaren Spektrum.
Fluoreszierende Moleküle und Materialien gibt es in allen Formen und Größen. Einige sind intrinsisch fluoreszierend, wie Chlorophyll und die Aminosäurereste Tryptophan (Trp), Phenylalanin (Phe) und Tyrosin (Tyrosin). Andere sind Moleküle, die speziell als stabile organische Farbstoffe oder Tags synthetisiert werden, die ansonsten nicht fluoreszierenden Systemen hinzugefügt werden. Es gibt ganze Kataloge davon. Typischerweise besitzen organische fluoreszierende Moleküle aromatische Ringe und pi-konjugierte Elektronen. Je nach Größe und Struktur können organische Farbstoffe aus dem UV in das nahe IR-Gebiet abtreten.
Hier ist eine zufällige Auswahl einiger gängiger Fluorophore, die den UV- und sichtbaren Bereich abdecken. Einige seltene Erden, oder Lanthanide, haben höher gefüllte elektronische Orbitale, bei denen Elektronen aufgrund von Ladungsübertragungen von Metallliganden zwischen 4f-5d und sogar 4f-4f-Orbitalen übergehen. (Bunzli, 1989) Es gibt viele Lichtbildmoleküle, wie einige Aminosäuren, Chlorophylle und natürliche Pigmente. Andere sind hochgradig für sehr spezifische Anwendungen der Fluoreszenzspektroskopie entwickelt.
Einige der Kategorien fluoreszierender Moleküle und Materialien sind:
Andere Moleküle und Materialien wie fluoreszierende Proteine, Halbleiter, Phosphore und seltene Erden gehören zu den häufig verwendeten fluoreszierenden Proben. Polymere mit konjugierten Aromaten oder Dienen weisen ebenfalls häufig fluoreszierende Eigenschaften auf. Natürlich werden ständig neue Materialien entwickelt.
Für das umfassendste Buch zur Fluoreszenzspektroskopie lesen Sie bitte Dr. Joseph Lakowicz' Buch "Principles of Fluorescence Spectroscopy", dritte Auflage.
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