Was ist ratiometrische Fluoreszenz?

Ratiometrische Fluoreszenz ist die Methode, bei der Intensitäten bei zwei oder mehr Wellenlängen eines Anregungs- oder Emissionsspektrums gemessen werden, um Veränderungen in der lokalen Umgebung zu erkennen. Typischerweise wird eine Sonde verwendet, die speziell auf einen Umweltparameter wie Ionenkonzentration, pH-Wert, Viskosität oder Polarität reagiert.

Die Anwendung von ratiometrischen Farbstoffen zur Bestimmung von sondenempfindlichen Eigenschaften wie der Ionenkonzentration kann durch Messung von Spektren oder Kinetik genutzt werden.

Im Spektrum von Fura-2 sieht man, dass die Fluoreszenzanregung zwei Spitzen aufweist, die direkt die Bindung von freiem ionischem Kalzium in Lösung widerspiegeln. Bei hohen freien Calciumkonzentrationen ist der Anregungspeak bei 340 nm vergleichsweise hoch. Wenn die Konzentration des freien ionischen Calciums niedrig ist, steigt der Anregungspeak bei 380 nm im Verhältnis zum Peak bei 340 nm.

Das Verhältnis der Intensitäten bei zwei Anregungswellenlängen aus diesen Peaks korreliert direkt mit der intrazellulären Konzentration des freien ionischen Kalziums. Die Messung des Fluoreszenzverhältnisses bei 510 nm bei Anregung bei 340 nm und 380 nm über die Zeit ergibt eine zeitbasierte Darstellung, wie sich die Calciumkationenkonzentration einer Lösung verändert. Die zelluläre Aufnahme von freiem ionischem Kalzium wird auf diese Weise gemessen.

Es gibt andere Sonden, die Fluoreszenzspektren aufweisen, die sich ähnlich mit physikalischen Eigenschaften wie dem pH-Wert des Lösungsmittels und den Konzentrationen anderer Ionen wie Natrium, Kalium und Magnesium unterscheiden.

Hier ist ein Diagramm des Verhältnisses, das die intrazelluläre Kalziumreaktion einer mit Fura-2 geladenen Atriumszelle zeigt. Durch die Messung des Verhältnisses zwischen den beiden Intensitäten über die Zeit kann die Konzentration der Calciumionen direkt mit dieser kinetischen Kurve korreliert werden.