Fluorescencja - Analiza Retikulocytów

HORIBA wykorzystuje cytometrię przepływową i pomiar impedancji za pomocą odczynnika o nazwie ABX Fluocyte, który zawiera barwnik fluorescencyjny – oranż tiazolowy (TO), barwnik cyjaninowy, którego wzbudzenie następuje w obszarze widzialnym przy λ = 488 nm. Jest to barwnik specyficzny dla kwasów nukleinowych, który wnika do komórek przez przepuszczalność. Po związaniu z RNA następuje 3000-krotny wzrost emisji fluorescencji. Jest to jeden z barwników zalecanych przez wytyczne NCCLS-CLSI do zliczania retikulocytów. TO stał się najczęściej stosowanym barwnikiem ze względu na dokładność zliczania i praktyczność w laboratoriach klinicznych z komercyjnymi cytometrami przepływowymi z laserami o stosunkowo niskiej mocy w zakresie widzialnym.

Stopień emisji fluorescencji wywołanej wzbudzeniem barwnika jest proporcjonalny do ilości RNA w erytrocycie.

Po osiągnięciu punktu barwienia zawiesina jest przenoszona na stół optyczny z laserem w celu przeprowadzenia pomiaru. Stół optyczny z laserem jednocześnie mierzy fluorescencję komórek przechodzących przez punkt pomiarowy do kuwety przepływowej oraz objętość za pomocą impedancji. Kuweta przechodząca przez kuwetę przepływową dostarcza 2 rodzaje informacji:

• Wielkość komórki mierzona za pomocą rezystywności CIS (sygnału impedancji komórki)
• Światło fluorescencji ortogonalnej (OFL): Fluorescencja jest zbierana za pomocą soczewki skupionej na przepływowej kuwecie optycznej i umieszczonej pod kątem 90° od wiązki światła, filtra interferencyjnego specyficznego dla barwienia TO, który wybiera tylko długość fali fluorescencyjnej, oraz fotopowielacza.

Macierz retikulocytów powstaje na podstawie dwóch pomiarów: objętości rezystywności (CIS) i fluorescencji ortogonalnej (OFL) komórek, odpowiednio na osiach X i Y. Dojrzałe czerwone krwinki bez RNA wykazują słaby lub żaden sygnał fluorescencyjny. Znajdują się one na dole macierzy i są rozmieszczone poziomo zgodnie z ich wartościami MCV i RDW. Retikulocyty są oddzielane od czerwonych krwinek na podstawie ich fluorescencji, która jest proporcjonalna do zawartości RNA i ich niedojrzałości. Elementy o największej fluorescencji, które są wysycone w górnej części macierzy, są najbardziej niedojrzałe. W tym obszarze mogą również znajdować się erytroblasty.