Technologia

Podwójny hydrodynamiczny układ sekwencyjny (DHSS)

Technologia Double Hydrodynamic Sequential System (DHSS) to technologia opracowana przez HORIBA. Jej celem jest zapewnienie liniowego przepływu komórek poprzez komory wykonujące pomiary impedancji elektrycznej i ekstynkcji optycznej, co pomaga w dokładnym różnicowaniu subpopulacji leukocytów (WBC) i płytek krwi. Podwójne ogniskowanie hydrodynamiczne to technika wykorzystywana do uzyskiwania dokładnych wyników z cytometru przepływowego. DHSS jest efektywną metodą służącą do specjalistycznych analiz krwi.

Rys 1. Metoda DHSS

1. Komórki przechodzą przez otwór pojedynczo (①), gdzie są liczone i mierzone za pomocą prądu elektrycznego (zmiany impedancji). Jest to wykorzystywane do pomiaru objętości komórki.

2. Następnie każda z nich przecina wiązkę światła padającą pod kątem 0° (➁), co pozwala określić złożoność komórek.
• Część światła jest pochłaniana przez zawartość komórki,
• Większa część jest odchylana przez strukturę komórki (światło rozproszone),
• Pozostała część przechodzi przez komórkę lub omija ją.

Analizatory HORIBA Medical wykorzystują połączenie pomiaru optycznego i impedancji elektrycznej do zliczania i analizy komórek przechodzących przez system elektrod z mikroaperturą. Impuls elektrody jest następnie wykorzystywany do zliczania komórek oraz pomiaru wielkości i rozmieszczenia leukocytów, erytrocytów i trombocytów.

Rys. 2 Metoda DHSS

Zasady pomiaru LMNE

Specjalny odczynnik HORIBA Nucediff lizuje erytrocyty i stabilizuje leukocyty (WBC) w ich naturalnej postaci. Następnie dla każdej komórki jest wykonany pomiar ekstynkcji optycznej (struktura wewnętrzna) i rezystywności (objętość), co pozwala na określenie całkowitej liczby komórek jądrzastych oraz różnicowanie limfocytów, monocytów, neutrofili, eozynofili, limfocytów atypowych, niedojrzałych populacji i erytroblastów.

Komórki krwi

Zasada działania LMNE opiera się na cytometrii przepływowej z wykorzystaniem podwójnego hydrodynamicznego układu sekwencyjnego (DHSS). Dla każdej komórki przechodzącej przez ten układ określane są dwie charakterystyki: objętość i wygaszenie światła optycznego.

Opis macierzy i komórek

DHSS_figure3_technology_image_HORIBA Medycyna

Rysunek 3: 1= Limfocyty 2= Monocyty 3= Neutrofile 4= Eozynofile 5= IML (Niedojrzałe komórki limfocytowe) 6= IMM (Niedojrzałe komórki monoocytowe) 7= IMG (Niedojrzałe komórki granulocytowe) 8= Erytroblasty lub agregaty płytek 9= Szum tła niski10= Szum tła wysoki

Na podstawie pomiarów ekstynkcji i oporności leukocytów tworzona jest macierz z objętościami komórek na osi X i ekstynkcją na osi Y. Dokładna analiza umożliwia wyraźne rozróżnienie subpopulacji leukocytów.

Progi populacji komórek (niektóre z nich są mobilne, a inne nieruchome) wyznaczają granice normalnej morfologii leukocytów. Zmiany w morfologii określonej populacji są oznaczone na macierzy przesunięciem w odpowiadającej jej populacji.

Stałe progi (rysunek 3) są zaznaczone na czarno, a progi ruchome na czerwono na powyższym rysunku. Niebieskie progi następują po czerwonych podczas dostosowywania macierzy. Macierz umożliwia obliczenie procentowej populacji leukocytów.

Erytroblasty (NRBC)

Erytroblasty to niedojrzałe krwinki czerwone z jądrem. Cytometr przepływowy wykrywa jądra komórek NRBC uwolnione po lizie ich błon przez Nucediff. Ze względu na niewielkie rozmiary i niską absorpcję, są one umieszczane w lewej części populacji limfocytów na matrycy (ramka nr 8 na rysunku 3). W tej strefie możemy również znaleźć agregaty płytek krwi. Analizator może je odróżnić od erytroblastów dzięki specyficznym algorytmom. W żadnym przypadku NRBC i agregaty płytek krwi nie są uwzględniane w liczbie leukocytów.

Rys. 4. Metoda DHSS

Morfologia komórek w pomiarze DHSS:

W analizatorach HORIBA pomiar ekstynkcji jest wykonywany za pomocą źródła światła o niskiej koherencji. Źródło optyczne o niskiej koherencji charakteryzuje się różnymi składowymi widmowymi i przestrzennymi wiązki światła. Pomiar ten pozwala z jednej strony określić morfologię różnych organelli komórkowych, a z drugiej – charakterystykę wewnątrzcytoplazmatyczną. Apertura skupiająca wiązkę światła umożliwia obserwację komórek.

Pomiar ten jest mniej wrażliwy na anizotropię komórki oraz jej położenie lub orientację w wiązce (rysunek 4) i dostarcza informacji zależnych od wewnętrznych cech komórki.

Źródło światła o niskiej koherencji:

W przypadku światła polichromatycznego wykorzystującego wiązkę o niskiej spójności przestrzennej (wiązkę rozbieżną) pomiar jest mniej wrażliwy na położenie lub orientację komórki w wiązce.

Dlaczego światło niskokoherentne a nie światło laserowe?

Biorąc pod uwagę złożoność struktury i morfologii leukocytów, metoda identyfikacji i liczenia łącząca cytochemię i pomiar słabego światła koherentnego (oświetlenie o niskiej koherencji) okazuje się metodą lepiej różnicującą i bardziej niezawodną w porównaniu z metodami laserowymi.

Rys. 5. Porównanie DHSS z technologią wykorzystującą laser

	Laser	Lampa emitująca światło niskokoherentne
Zalety	Duża moc światła w komorze przepływowej (90% mocy źródła). Odpowiedni do metod fluorescencyjnych.	Jednorodność rozkładu natężenia wiązki. Bardzo niski poziom szumów (wysoka częstotliwość).
Ograniczenia	Powstawanie szumu plamkowego (efekt speckle) Trudności z precyzyjnym pomiarem objętości. Gaussowski profil wiązki.	Niska wydajność (0,0004%). Zużycie energii elektrycznej, emisja ciepła. Nie nadaje się do metod fluorescencyjnych.

Pomiary optyczne wykonywane na analizatorach Yumizen pozwalają na uzyskanie dokładniejszych informacji na temat objętości, stosunku jądrowo-cytoplazmatycznego i struktury wewnętrznej każdej komórki. Ta dokładność jest szczególnie przydatna przy identyfikacji patologii.

Optyczna analiza ekstynkcji płytek krwi

Podobnie jak w przypadku analizy WBC, płytki krwi zlicza się z wykorzystaniem sekwencyjnego systemu Double Hydrodynamic; próbki są analizowane w trybie pomiaru optycznego. Pomiar PLT Ox odróżnia płytki krwi od populacji RBC na podstawie współczynnika refrakcji. Zasada pomiaru jest podobna do metody LMNE.

1. Po rozcieńczeniu próbka jest transportowana z komory do toru optycznego metodą aspiracji, a następnie poddawana analizie w komorze pomiarowej. Rozcieńczona próbka jest poddawana podwójnemu hydrodynamicznemu ogniskowaniu strumienia, a następnie przepływa przez aperturę komory przepływowej LMNE i okno optyczne. Każda komórka jest analizowana zarówno metodą impedancyjną, umożliwiającą określenie jej objętości, jak i metodą absorpcyjną, pozwalającą ocenić jej właściwości cytochemiczne.

2. Na podstawie tych pomiarów tworzona jest macierz, w której na osi X zaznaczone są objętości, a na osi Y ekstynkcja optyczna.

Rys. 6. Reprezentacje macierzy PLTOx

PLT Ox:

Ten parametr odpowiada procentowej liczbie płytek krwi w stosunku do RBC zidentyfikowanych na matrycy, pomnożonej przez liczbę RBC zidentyfikowanych w komorze. Nie ma potrzeby kalibrowania tego parametru, ponieważ opiera się on na kalibracji RBC. Jednocześnie urządzenie wykonuje cykl RBC/PLT Low Value.

W jaki sposób podwójny hydrodynamiczny sekwencyjny system poprawia dokładność analizy hematologicznej?

Hydrodynamiczne ogniskowanie wykorzystuje strumień płynu osłonowego do kontroli przepływu próbki przez aperturę oraz do utrzymywania jej wzdłuż osi centralnej. W systemie HORIBA Double Hydrodynamic Sequential System zastosowano podwójne hydrodynamiczne ogniskowanie, które eliminuje wpływ efektów przyściennych (edge effects) na wyniki pomiarów oraz sprzyja ujednoliceniu orientacji analizowanych cząstek podczas przepływu przez strefę pomiarową.

Czym jest efekt przyścienny?

Obecność silniejszych gradientów elektrycznych w pobliżu krawędzi pola elektrycznego niż w jego centrum może wpływać na dokładność i zniekształcać wielkość impulsu elektrycznego, co skutkuje przeszacowaniem rozmiaru cząstki. Dzieje się tak, gdy cząstka przechodzi przez mikroaperturę nie całkowicie centrycznie. Sytuację dodatkowo komplikuje orientacja cząstki w aperturze.

Zastosowanie DHSS pozwala uniknąć wielu potencjalnych problemów związanych z przepływem przez aperturę. Strumień próbek jest otoczony płynem osłonowym, gdy przechodzi przez centralną oś apertury. Przepływ laminarny pozwala strumieniowi próbek na wystarczające zwężenie, aby oddzielić i ustawić komórki w pojedynczym rzędzie w celu przejścia przez strefę pomiaru. Zewnętrzny płyn osłonowy eliminuje recyrkulację komórek z powrotem do strefy pomiaru.

Bibliografia

1. Kachel V; Electrical Resistance Pulse sizing: Coulter sizing. Flow cytometry and Sorting. Second Edition, T. Willy & Sons, 1990; p 45-80.
2. Al Quddus N, moussa W.A and Bhattacharjee S., Motion of a spherical particle in a cylindrical channel using arbitrary Lanrangian-Eulerian method., J. Colloid and Interface Science, 2008; 317:620-630.
3. European patent EP 0 425 381, Apparatus for counting and determination of at least one leucocyte-subpopulation. Filing date: 25 october 1990; Lefevre D; Champseix H.; Champseix S.
4. BLOOD CELLS A practical Guide, Barbara J.Bain, Fourth edition (2006) Blackwell Publishing. Barbara J.Bain Professor of Diagnostic Haematology St Mary’s Hospital Campus of Imperial College Faculty of Medicine, London and Honorary Consultant Haematologist, St Mary’s Hospital London.
5. Optics of Biological Particles, series II: mathematics, Physics and Chemistry – Vol.238 NATO Science Series; Alfons Hoestra University of Amsterdam, The Netherlands. Valeri Maltsev Institute of Chemical Kinetics and Combustion, Novosibirsk, Russia. Gorden Videen Army Research Laboratory, Adelphi, MD, USA, University of Amsterdam, The Netherlands.
6. Lasers and Current Optical Techniques in Biology, Comprehensive series in photochemistry and photobiology- volume 4 RS.C , Giuseppe Palumbo Dipartemento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare”L.Califano”, Università di Napoli “Federico II”, Napoli, Italia. Riccardo Pratesi Dipartimento di Fisica, Università di Firenze, Sesto Fiorentino (Fi), Italia.
7. Blood Cell Biology, Optics and Related Technologies, Readout HORIBA Technical Reports, English edition N°8, august 2004 . Philippe Nerin, Research Director Horiba Medical, PhD, Didier Lefèvre, R&D Department
8. Determination of volume, shape and refractive index of individual blood platelets; I.V. Kolesnikovaa,b, S.V. Potapovb, M. A. Yurkinb,c, A.G. Hoekstrac , V.P. Maltseva,b and K.A. Semyanovb, a Novosibirsk State University, Pirogova Str. 2, 630090, Novosibirsk, Russia b Institute of Chemical Kinetics and Combustion, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Institutskaya Str. 3, 630090, Novosibirsk, Russia c Faculty of Science, Section Computational Science, of the University of Amsterdam, Kruislaan 403, 1098 SJ, Amsterdam, The Netherlands.
9. UNDERSTANDING CONJUGATE PLANES AND KÖHLER ILLUMINATION Michael W. Davidson and Thomas J. Fellers; National High Magnetic Field Laboratory, The Florida State University, 1800 E. Paul Dirac Dr., Tallahassee, Florida 32306.