Technologia

Podwójny hydrodynamiczny pomiar sekwencyjny (DHSS - Double Hydrodynamic Sequential System)

Technologia podwójnego hydrodynamicznego systemu sekwencyjnego (DHSS) została opracowana przez firmę HORIBA. Jej znaczenie polega na zapewnieniu liniowego przepływu komórek za pomocą metody impedancji elektrycznej i pomiarów optycznych, co pomaga w dokładnym rozróżnieniu subpopulacji białych krwinek oraz płytek krwi. Podwójne ogniskowanie hydrodynamiczne to technika stosowana w celu uzyskania dokładnych wyników z cytometru przepływowego. Technologia DHSS ułatwia przeprowadzanie specjalistycznych badań krwi.

Rys 1. Metoda DHSS

1. Komórki przechodzą pojedynczo przez otwór (① na rysunku 1), gdzie są zliczane i mierzone na podstawie pomiaru prądu elektrycznego (zmian impedancji). Jest to pomiar rezystancyjny objętości komórek.

2. Następnie każda z nich przecina wiązkę światła padającą pod kątem 0° (➁ na rysunku 1), co pozwala określić złożoność komórki.
• Część światła jest pochłaniana przez zawartość komórki,
• większa część ulega odchyleniu przez strukturę komórki (światło rozproszone),
• pozostała część przechodzi przez komórkę lub omija ją.

Analizatory HORIBA Medical wykorzystują połączenie pomiaru optycznego i impedancji elektrycznej do zliczania i analizy komórek przechodzących przez system elektrod z mikroaperturą. Impuls elektrody jest następnie wykorzystywany do zliczania komórek oraz pomiaru wielkości i rozmieszczenia leukocytów, erytrocytów i trombocytów.

Rys. 2 Metoda DHSS

Zasady pomiaru LMNE

Specjalny odczynnik HORIBA „Nucediff” powoduje lizę krwinek czerwonych i stabilizuje leukocyty (WBC) w ich naturalnej postaci. Następnie każda komórka jest mierzona zarówno pod kątem ekstynkcji optycznej (struktura wewnętrzna), jak i rezystywności (objętość), co pozwala na obliczenie całkowitej liczby komórek jądrzastych oraz wykonanie analizy różnicowej limfocytów, monocytów, neutrofili, eozynofili, limfocytów atypowych, populacji niedojrzałych i erytroblastów.

Komórki krwi

Zasada działania detektora LMNE opiera się na cytometrii przepływowej z wykorzystaniem podwójnego hydrodynamicznego systemu sekwencyjnego (DHSS). Dla każdej komórki przechodzącej przez ten system określane są dwie cechy: objętość oraz ekstynkcja optyczna światła.

Opis macierzy i komórek

DHSS_figure3_technology_image_HORIBA Medycyna

Rysunek 3: 1 = limfocyty 2 = monocyty 3 = neutrofile 4 = eozynofile 5 = IML (Niedojrzałe komórki limfocytowe) 6 = IMM (Niedojrzałe komórki monocytowe) 7 = IMG (Niedojrzałe komórki granulocytowe) 8 = Erytroblasty lub agregaty płytek krwi 9 = Niski poziom szumu tła 10 = Wysoki poziom szumu tła

Na podstawie pomiarów ekstynkcji i oporności leukocytów sporządzono matrycę, w której na osi X przedstawiono objętości komórek, a na osi Y – ekstynkcję. Analiza obrazu matrycy pozwala na wyraźne rozróżnienie subpopulacji leukocytów.

Progi populacji komórek (część z nich ruchoma, a część nieruchoma) określają granice normy dla prawidłowej morfologii leukocytów. Zmiany w morfologii danej populacji są zaznaczone w tabeli poprzez przesunięcie odpowiadającej jej populacji.

Na poniższym rysunku progi stałe (rys. 3) są zaznaczone na czarno, a progi ruchome – na czerwono. Podczas dostosowywania macierzy progi niebieskie podążają za czerwonymi. Macierz umożliwia obliczenie procentowego udziału populacji leukocytów zgodnie z poniższym rysunkiem:

Erytroblasty (NRBC)

Erytroblasty są niedojrzałymi krwinkami czerwonymi zawierającymi jądro komórkowe. Cytometr przepływowy wykrywa jądra komórek NRBC (ang. Nucleated Red Blood Cells), które zostają uwolnione po zlizowaniu ich błon komórkowych przez odczynnik Nucediff. Ze względu na niewielki rozmiar i niską absorbancję komórki te są lokalizowane po lewej stronie populacji limfocytów na matrycy (pole nr 8 na Rysunku 3). W tej strefie mogą również występować agregaty płytek krwi. Aparat potrafi odróżnić je od erytroblastów dzięki zastosowaniu specjalnych algorytmów analitycznych. We wszystkich przypadkach zarówno NRBC, jak i agregaty płytek krwi, nie są uwzględniane w zliczaniu leukocytów (WBC).

Rys. 4. Metoda DHSS

Morfologia komórek w pomiarze DHSS:

Copilot said: W analizatorach HORIBA pomiar ekstynkcji (osłabienia wiązki światła) wykonywany jest z wykorzystaniem źródła światła o niskiej koherencji. Źródło światła o niskiej koherencji charakteryzuje się zróżnicowaniem składowych spektralnych i przestrzennych wiązki świetlnej. Pomiar ten umożliwia z jednej strony ocenę morfologii różnych organelli komórkowych, a z drugiej strony analizę cech wewnątrzcytoplazmatycznych komórek. Wysoka apertura numeryczna wiązki światła pozwala na szczegółową obserwację komórek.

Pomiar ten jest mniej wrażliwy na anizotropię komórki oraz jej położenie lub orientację w wiązce (rysunek 4) i dostarcza informacji zależnych od wewnętrznych cech komórki.

Źródło światła o niskiej koherencji:

W przypadku światła wielobarwnego o niskiej spójności przestrzennej (wiązka rozbieżna) pomiar jest mniej wrażliwy na położenie lub orientację komórki w wiązce.

Dlaczego światło niskokoherentne a nie światło laserowe?

Copilot said: Biorąc pod uwagę złożoność budowy i morfologii leukocytów, metoda ich identyfikacji i zliczania, łącząca cytochemię z pomiarem światła o niskiej koherencji (low coherence illumination), okazuje się bardziej selektywna i bardziej niezawodna niż metody wykorzystujące laser.

Rys. 5. Porównanie DHSS z technologią wykorzystującą laser

	Laser	Lampa emitująca światło o niskiej koherencji
Zalety	Wysoka moc w komorze przepływowej (90% mocy źródła światła). Nadaje się do fluorescencji.	Jednorodny (płaski) rozkład natężenia wiązki świetlnej. Bardzo niski poziom szumu (wysoka częstotliwość).
Ograniczenia	Obecność szumu optycznego i efektu speckle (plamkowania). Ograniczona przydatność do dokładnych pomiarów objętości. Wiązka światła o gaussowskim rozkładzie intensywności.	Niska wydajność (0,0004%). Zużycie energii elektrycznej, emisja ciepła. Nie nadaje się do fluorescencji.

Pomiary optyczne przeprowadzane za pomocą analizatorów Yumizen pozwalają uzyskać dokładniejsze informacje na temat objętości, stosunku jądra do cytoplazmy oraz wewnętrznej struktury każdej komórki, a ta niezawodność jest szczególnie przydatna przy identyfikacji nieprawidłowości.

Optyczna analiza ekstynkcji płytek krwi

Podobnie jak w przypadku analizy białych krwinek, liczenie płytek krwi odbywa się z wykorzystaniem podwójnego sekwencyjnego systemu hydrodynamicznego, gdy próbki są przetwarzane w trybie „płytki optyczne”. Tryb „płytki optyczne” pozwala odróżnić płytki krwi od populacji czerwonych krwinek na podstawie współczynnika załamania światła. Zasada pomiaru jest podobna do tej stosowanej w trybie LMNE.

1. Po rozcieńczeniu próbka jest przenoszona z komory do układu optycznego za pomocą aspiracji, a następnie analizowana w komorze pomiarowej. Rozcieńczona próbka jest otoczona podwójnym płaszczem hydrodynamicznym i przepływa przez aperturę komórki przepływowej LMNE oraz przez okno optyczne. Każda komórka jest analizowana jednocześnie pod względem rezystywności (objętości) oraz absorpcji światła (cytochemii).

2. Na podstawie tych pomiarów sporządza się wykres, w którym na osi X przedstawiono objętości, a na osi Y – ekstynkcję optyczną.

Rys. 6. Reprezentacje macierzy PLTOx

PLT Ox:

Parametr ten odpowiada procentowej zawartości płytek krwi w stosunku do liczby krwinek czerwonych zidentyfikowanych na matrycy, pomnożonej przez liczbę krwinek czerwonych. Nie ma potrzeby kalibrowania tego parametru, ponieważ opiera się on na kalibracji krwinek czerwonych. W tym samym czasie urządzenie uruchamia cykl dla niskich wartości RBC/PLT.

W jaki sposób podwójny hydrodynamiczny sekwencyjny system poprawia dokładność analizy hematologicznej?

Ogniskowanie hydrodynamiczne wykorzystuje przepływ płynu osłonowego (sheath flow) do kontrolowania szybkości przepływu próbki wewnątrz apertury oraz do kierowania strumienia próbki wzdłuż centralnej osi apertury. W analizatorach HORIBA stosowany jest podwójny sekwencyjny system ogniskowania hydrodynamicznego (Double Hydrodynamic Sequential System), który zapobiega wpływowi efektów brzegowych na wyniki pomiarów oraz pomaga ustawić cząstki w jednakowej orientacji podczas przechodzenia przez strefę pomiarową.

Czym jest efekt przyścienny?

Obecność silniejszych gradientów elektrycznych w pobliżu krawędzi pola elektrycznego niż w jego centrum może wpływać na dokładność pomiaru; może ona zniekształcać wielkość impulsu elektrycznego, co prowadzi do przeszacowania wielkości cząstki. Dzieje się tak, gdy cząstki przechodzą przez aperturę w różnych pozycjach. Sytuację dodatkowo komplikuje orientacja cząstki podczas przechodzenia przez aperturę.

Zastosowanie systemu DHSS (Double Hydrodynamic Sequential System) pozwala uniknąć wielu potencjalnych problemów charakterystycznych dla systemów opartych na aperturze. Strumień próbki jest otoczony płynem osłonowym (sheath fluid) podczas przepływu wzdłuż centralnej osi apertury. Przepływ laminarny umożliwia odpowiednie zwężenie centralnego strumienia próbki, co pozwala na rozdzielenie i uporządkowanie komórek w pojedynczy szereg przed ich przejściem przez strefę detekcji. Zewnętrzny strumień płynu osłonowego eliminuje zjawisko recyrkulacji komórek z powrotem do strefy pomiarowej, co zwiększa dokładność i powtarzalność pomiarów.

Bibliografia

1. Kachel V; Electrical Resistance Pulse sizing: Coulter sizing. Flow cytometry and Sorting. Second Edition, T. Willy & Sons, 1990; p 45-80.
2. Al Quddus N, moussa W.A and Bhattacharjee S., Motion of a spherical particle in a cylindrical channel using arbitrary Lanrangian-Eulerian method., J. Colloid and Interface Science, 2008; 317:620-630.
3. European patent EP 0 425 381, Apparatus for counting and determination of at least one leucocyte-subpopulation. Filing date: 25 october 1990; Lefevre D; Champseix H.; Champseix S.
4. BLOOD CELLS A practical Guide, Barbara J.Bain, Fourth edition (2006) Blackwell Publishing. Barbara J.Bain Professor of Diagnostic Haematology St Mary’s Hospital Campus of Imperial College Faculty of Medicine, London and Honorary Consultant Haematologist, St Mary’s Hospital London.
5. Optics of Biological Particles, series II: mathematics, Physics and Chemistry – Vol.238 NATO Science Series; Alfons Hoestra University of Amsterdam, The Netherlands. Valeri Maltsev Institute of Chemical Kinetics and Combustion, Novosibirsk, Russia. Gorden Videen Army Research Laboratory, Adelphi, MD, USA, University of Amsterdam, The Netherlands.
6. Lasers and Current Optical Techniques in Biology, Comprehensive series in photochemistry and photobiology- volume 4 RS.C , Giuseppe Palumbo Dipartemento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare”L.Califano”, Università di Napoli “Federico II”, Napoli, Italia. Riccardo Pratesi Dipartimento di Fisica, Università di Firenze, Sesto Fiorentino (Fi), Italia.
7. Blood Cell Biology, Optics and Related Technologies, Readout HORIBA Technical Reports, English edition N°8, august 2004 . Philippe Nerin, Research Director Horiba Medical, PhD, Didier Lefèvre, R&D Department
8. Determination of volume, shape and refractive index of individual blood platelets; I.V. Kolesnikovaa,b, S.V. Potapovb, M. A. Yurkinb,c, A.G. Hoekstrac , V.P. Maltseva,b and K.A. Semyanovb, a Novosibirsk State University, Pirogova Str. 2, 630090, Novosibirsk, Russia b Institute of Chemical Kinetics and Combustion, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Institutskaya Str. 3, 630090, Novosibirsk, Russia c Faculty of Science, Section Computational Science, of the University of Amsterdam, Kruislaan 403, 1098 SJ, Amsterdam, The Netherlands.
9. UNDERSTANDING CONJUGATE PLANES AND KÖHLER ILLUMINATION Michael W. Davidson and Thomas J. Fellers; National High Magnetic Field Laboratory, The Florida State University, 1800 E. Paul Dirac Dr., Tallahassee, Florida 32306.