Fluorescencja - analiza Retikulocytów

HORIBA wykorzystuje cytometrię przepływową i pomiar impedancji oraz odczynnik o nazwie ABX Fluocyte, który zawiera barwnik fluorescencyjny – oranż tiazolowy (TO), barwnik cyjaninowy, którego wzbudzenie następuje w obszarze widzialnym przy λ = 488 nm. Jest to barwnik specyficzny dla kwasów nukleinowych, który wnika do komórek. Po związaniu z RNA następuje 3000-krotny wzrost emisji fluorescencji. Jest to jeden z barwników zalecanych przez wytyczne NCCLS-CLSI do zliczania retikulocytów. TO stał się najczęściej stosowanym barwnikiem ze względu na dokładność zliczania i praktyczność w laboratoriach klinicznych z cytometrami przepływowymi z laserami o stosunkowo niskiej mocy w zakresie widzialnym.

Stopień emisji fluorescencji wywołanej wzbudzeniem barwnika jest proporcjonalny do ilości RNA w erytrocycie.

Po zakończeniu barwienia komórek zawiesina jest następnie przenoszona do układu optycznego z laserem w celu wykonania pomiaru. Laserowy układ optyczny jednocześnie mierzy fluorescencję komórek przechodzących przez punkt pomiarowy w komorze przepływowej (flowcell) oraz ich objętość metodą impedancyjną. Komórka przechodząca przez komorę przepływową dostarcza dwóch rodzajów informacji:

• Wielkość komórki mierzona za pomocą rezystywności CIS (sygnału impedancji komórki)
• Światło fluorescencji ortogonalnej (OFL): Fluorescencja jest zbierana za pomocą soczewki skupionej na przepływowej kuwecie optycznej i umieszczonej pod kątem 90° od wiązki światła, filtra interferencyjnego specyficznego dla barwienia TO, który wybiera tylko długość fali fluorescencyjnej, oraz fotopowielacza.

Macierz retikulocytów jest tworzona na podstawie dwóch pomiarów: objętości oporowej (CIS – Conductivity/Impedance Signal) oraz fluorescencji prostopadłej (OFL – Orthogonal Fluorescence) komórek, przedstawianych odpowiednio na osiach X i Y. Dojrzałe krwinki czerwone, pozbawione RNA, wykazują niewielki lub zerowy sygnał fluorescencyjny. Są one zlokalizowane w dolnej części macierzy i rozmieszczone poziomo zgodnie z wartościami MCV (średnia objętość krwinki czerwonej) oraz RDW (wskaźnik zróżnicowania objętości erytrocytów). Retikulocyty są odróżniane od dojrzałych krwinek czerwonych dzięki swojej fluorescencji, której intensywność jest proporcjonalna do zawartości RNA i stopnia ich niedojrzałości. Najsilniej fluorescencyjne elementy, zlokalizowane w górnej części macierzy, reprezentują najbardziej niedojrzałe retikulocyty Erytroblasty mogą również się znajdować w tym obszarze.