La microscopie confocale Raman fait référence à la capacité de filtrer spatialement le volume d'analyse de l'échantillon, dans les axes XY (latéral) et Z (profondeur).
La microscopie Raman associe un spectromètre Raman à un microscope optique standard, permettant ainsi la visualisation à fort grossissement d'un échantillon et l'analyse Raman grâce à un spot laser microscopique. La microscopie Raman est simple : il suffit de placer l'échantillon sous le microscope, de faire la mise au point et de prendre une mesure.
L'ajout d'un microscope à un spectromètre Raman ne permet pas de contrôler le volume d'échantillonnage ; un filtre spatial est alors nécessaire. La microscopie confocale Raman permet de filtrer spatialement le volume d'analyse de l'échantillon, selon les axes XY (latéral) et Z (profondeur).
Plusieurs méthodes sont actuellement utilisées (par exemple, l'ouverture confocale réelle ou les techniques pseudo-confocales de binning de fentes), et certaines sont plus performantes que d'autres. Cependant, il est bien établi qu'un microscope Raman confocal réel permet d'analyser des particules individuelles ou des couches de dimensions aussi petites que 1 µm et moins.
Pour une véritable conception confocale, la résolution spatiale typique est de l'ordre de 0,5 à 1 µm.
Pour une conception confocale authentique, les limites de la résolution spatiale sont principalement définies par la longueur d'onde et la qualité du faisceau laser utilisé, ainsi que par le type d'objectif de microscope choisi, etc. Pour une résolution spatiale optimale, un objectif à fort grossissement et une excitation laser visible parfaitement adaptés produisent généralement des résultats optimaux. La résolution spatiale typique est de l'ordre de 0,5 à 1 µm.
Comme son nom l'indique, l'analyse Raman in situ à distance est une méthode permettant d'analyser un échantillon in situ et/ou à distance, sans avoir à en extraire une partie pour la transférer vers un spectromètre Raman. Elle est souvent utilisée en milieu industriel, notamment pour la surveillance des composants d'une réaction dans un réacteur (du petit flacon en verre aux réacteurs industriels) et l'analyse de produits chimiques à différents endroits des canalisations.
L'analyse Raman in situ à distance est souvent réalisée à l'aide de fibres optiques, permettant de coupler une tête de sonde Raman à un spectromètre (qui peut se trouver à plusieurs centaines de mètres du point d'analyse). Un seul câble transmet le laser à l'échantillon, tandis qu'une autre fibre transmet le signal Raman de l'échantillon à un spectromètre standard et à un système de détection. Ces deux câbles sont reliés à une tête de sonde Raman compacte et robuste qui focalise le laser sur l'échantillon et collecte le signal Raman.
Les sondes sont adaptées à une utilisation à hautes températures et pressions. Elles peuvent fonctionner en mode immersion (la tête d'analyse est plongée dans le liquide réactionnel) ou en mode stand-off (l'analyse est réalisée en focalisant le laser à travers une fenêtre transparente dans le réacteur ou la canalisation).
L'analyse Raman in situ peut être utilisée pour :
La spectroscopie Raman en transmission (ou TRS) est une forme d'analyse Raman idéale pour l'analyse en masse des matériaux opaques/turbides. La spectroscopie Raman en transmission repose sur la collecte de la lumière Raman se propageant à travers l'échantillon en direction du laser d'excitation. En effet, l'échantillon est illuminé par le laser d'excitation d'un côté, tandis que le signal Raman est collecté de l'autre.
Malgré l'opacité de l'échantillon, la lumière laser peut le traverser par diffusion. Nombre de ces photons contiennent des informations Raman, ce qui permet la spectroscopie Raman en transmission.
Contrairement aux spectromètres Raman et aux systèmes de microscope traditionnels, la géométrie de transmission permet une véritable analyse en vrac de l'ensemble du volume de l'échantillon (par exemple, un comprimé pharmaceutique).
La méthode Raman par transmission est sans contact, non invasive et non destructive. Elle ne nécessite aucune préparation d'échantillon. Il est important de noter que la mesure est insensible aux effets de la taille des particules, à l'homogénéité et à l'orientation de l'échantillon.
La spectroscopie Raman en transmission peut être utilisée pour comprendre :
La spectroscopie Raman par résonance est une variante de la spectroscopie Raman « normale ». Cette spectroscopie utilise une excitation laser à n'importe quelle longueur d'onde pour mesurer la diffusion Raman de cette lumière laser.
Malgré les nombreux problèmes pratiques causés par l’utilisation de différentes longueurs d’onde laser, le résultat final sera très similaire quelle que soit la longueur d’onde utilisée.
En résonance Raman, la longueur d'onde d'excitation est soigneusement choisie pour chevaucher (ou être très proche) une transition électronique, généralement dans une zone d'absorption UV-visible. Ce chevauchement peut entraîner des intensités de diffusion multipliées par 102 à 106, ce qui permet d'améliorer considérablement les limites de détection et les temps de mesure. Cependant, l'excitation coïncidant avec l'absorption UV-visible, le bruit de fond de fluorescence peut être important et plus problématique qu'avec une diffusion Raman « normale ».
Une approche alternative est la diffusion Raman exaltée de surface (SERS), qui offre des augmentations d'intensité d'un ordre de grandeur similaire. L'avantage de la SERS par rapport à la diffusion Raman par résonance réside dans la suppression de la fluorescence tandis que la diffusion Raman est exaltée, supprimant ainsi le problème de fond de fluorescence de la diffusion Raman par résonance.
Pour certaines applications spécifiques, les avantages de la résonance Raman peuvent être considérables. Par exemple, elle est utilisée pour l'analyse des polluants environnementaux, où des concentrations de l'ordre de quelques parties par milliard (ppb) et de quelques parties par million (ppm) peuvent être détectées.
En pratique, la résonance Raman peut être explorée sur n'importe quel système Raman, et la mesure est réalisée de manière standard. L'exigence évidente est de disposer d'une excitation laser adaptée pour satisfaire aux conditions de résonance.
La configuration en transmission permet l'utilisation d'objectifs à ouverture numérique (ON) maximale (y compris les objectifs à immersion). La configuration en réflexion est utilisable avec tout type d'échantillon (opaque et transparent), mais est limitée aux objectifs à ouverture numérique inférieure.
La spectroscopie Raman exaltée par pointe TERS) intègre la spectroscopie Raman à l'imagerie à résolution nanométrique. TERS est une technique chimique de super-résolution. Mieux encore, il s'agit d'une technique d'imagerie de super-résolution sans marquage, qui, grâce à notre nouvelle technologie, constitue une nouvelle technologie d'imagerie majeure.
L'imagerie TERS est réalisée avec un système AFM/Raman, où un microscope à sonde à balayage (SPM, utilisable en force atomique, effet tunnel ou force normale/de cisaillement) est intégré à un spectromètre Raman confocal par couplage optomécanique. Le microscope à sonde à balayage permet l'imagerie à l'échelle nanométrique ; le couplage optique amène le laser d'excitation à la pointe fonctionnalisée (ou sonde), et le spectromètre analyse la lumière Raman (ou autrement diffusée) pour fournir une image hyperspectrale avec un contraste chimique à l'échelle nanométrique.
Un système TERS repose sur une pointe métallique (généralement en or ou en argent) servant à concentrer le champ lumineux incident à l'apex. Cette pointe agit comme une nano-source lumineuse et un amplificateur de champ local, améliorant considérablement la sensibilité Raman (d'un facteur 103–107) et réduisant le volume sondé à la région « nano » immédiatement sous la pointe. Le couplage optique qui combine les deux instruments utilise un schéma confocal. Deux configurations différentes existent pour ce couplage : une en transmission et une en réflexion, chacune ayant ses avantages et ses inconvénients.
La configuration en transmission permet l'utilisation d'objectifs à ouverture numérique (ON) maximale (y compris les objectifs à immersion), ce qui offre une densité de puissance élevée au point focal et permet de collecter un signal élevé. Cependant, elle ne peut être utilisée que pour des échantillons transparents. La configuration en réflexion est utilisable pour tout type d'échantillon (opaque et transparent), mais est limitée aux objectifs à ouverture numérique inférieure.
En combinant le balayage point par point avec l'acquisition simultanée du spectre, des cartographies Raman en champ proche peuvent être réalisées avec une résolution latérale allant jusqu'à dix nanomètres ou moins.
Les dispositifs Raman de transmission pour applications pharmaceutiques sont disponibles dans d’autres pays que les États-Unis d’Amérique, l’Europe et l’Inde.
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