Qu'est-ce qu'un instrument Raman et comment fonctionne-t-il ?

Des longueurs d'onde laser allant de l'ultraviolet au proche infrarouge en passant par le visible peuvent être utilisées pour la spectroscopie Raman. Exemples typiques :

• Ultraviolet : 244 nm, 266 nm, 320 nm, 355 nm, 405 nm
• Visible : 458 nm, 473 nm, 515 nm, 532 nm, 594 nm, 633 nm, 660 nm
• Proche infrarouge : 785 nm, 830 nm, 980 nm, 1064 nm

Le choix de la longueur d’onde du laser a un impact important sur les capacités expérimentales :

Sensibilité

L'intensité de diffusion Raman est proportionnelle à λ^-4, où λ est la longueur d'onde du laser. Ainsi, un laser infrarouge produit une diminution de l'intensité de diffusion d'un facteur 15 ou plus par rapport aux lasers visibles bleu/vert.

Résolution spatiale                   

Le diamètre du spot laser limité par la diffraction peut être calculé selon l'équation : diamètre = 1,22 λ/NA (où λ est la longueur d'onde du laser et NA l'ouverture numérique de l'objectif du microscope utilisé). Par exemple, avec un laser de 532 nm et un objectif 0,90/100x, le diamètre théorique du spot sera de 0,72 µm ; avec le même objectif, un laser de 785 nm produirait un diamètre théorique de 1,1 µm. Ainsi, la résolution spatiale atteignable dépend en partie du choix du laser. 

Optimisation des résultats en fonction du comportement de l'échantillon

Par exemple:

• Les lasers bleus ou verts peuvent être utiles pour les matériaux inorganiques et les expériences de résonance Raman (par exemple, pour les nanotubes de carbone et autres matériaux en carbone) et la diffusion Raman exaltée en surface (SERS).
• Le rouge ou le proche infrarouge (660-830 nm) sont efficaces pour supprimer la fluorescence.
• Lasers ultraviolets pour la résonance Raman sur les biomolécules (telles que les protéines, l'ADN et l'ARN) et la suppression de la fluorescence.

Les lasers ultraviolets (UV) pour la spectroscopie Raman comprennent généralement des longueurs d'onde laser allant de 244 nm à 355 nm.

En théorie, la spectroscopie Raman UV ne diffère pas de l'analyse standard utilisant les longueurs d'onde laser visibles. Cependant, en pratique, elle présente un certain nombre de difficultés et d'inconvénients dont il faut tenir compte.

Avantages

• Avec certains échantillons, l'excitation par laser UV peut interagir de manière impossible avec des sources laser visibles. Par exemple, dans les matériaux semi-conducteurs, la profondeur de pénétration de la lumière UV est généralement de l'ordre de quelques nanomètres ; la spectroscopie Raman UV permet ainsi d'analyser sélectivement une fine couche superficielle (comme c'est souvent le cas pour les matériaux SOI, silicium sur isolant). Autre exemple : l'excitation UV peut induire une amplification de résonance spécifique avec des entités biologiques, notamment les protéines, l'ADN et l'ARN. L'analyse spécifique de ces matériaux au sein des tissus peut s'avérer difficile avec des longueurs d'onde laser visibles.
   
• La suppression de la fluorescence peut souvent être facilitée par l'utilisation de lasers UV, en séparant spectralement les signatures Raman et de fluorescence. Avec les lasers visibles, il est fréquent que Raman et fluorescence se superposent, et l'intensité incomparable de la fluorescence peut perturber (voire masquer) le spectre Raman. Avec l'excitation UV, le spectre Raman se situe près de la raie laser, tandis que la fluorescence est souvent légèrement atténuée aux longueurs d'onde supérieures. Ainsi, les deux signaux ne se chevauchent plus et la fluorescence ne pose plus de problème.
   
• L'excitation UV permet d'accroître la sensibilité, car l'efficacité de la diffusion Raman est proportionnelle à λ^-4, où λ est la longueur d'onde du laser. Ainsi, la diffusion Raman à 325 nm est 14 fois plus efficace qu'à 633 nm.

Inconvénients

• La technique Raman UV reste plus sophistiquée et requiert une plus grande expertise. Cela s'explique notamment par le fait que le faisceau laser est désormais invisible et que les lasers sont plus grands, plus complexes et considérablement plus coûteux.
   
• Les échantillons sont plus sensibles à la brûlure et à la dégradation sous l'effet du faisceau laser, car l'énergie par photon est accrue. Cependant, de nouvelles techniques, comme l'optique DuoScan™, permettent de diffuser rapidement le faisceau laser sur l'échantillon et d'éviter ainsi une brûlure immédiate. Par exemple, la cellulose brûle sous une excitation à 325 nm en quelques millisecondes, mais avec DuoScan™, elle résiste à la brûlure pendant plus de cinq minutes.
   
• De nombreux systèmes Raman conçus pour l'analyse du visible et du proche infrarouge ne conviennent pas à la spectroscopie Raman UV. Cette dernière exige des revêtements de miroirs, des objectifs de microscope, des réseaux de diffraction et un détecteur CCD spécifiques pour des résultats optimaux. Les systèmes modernes, tels que le LabRAM Odyssey peuvent être configurés pour fonctionner efficacement de l'UV à l'infrarouge sans compromis, mais ces exigences supplémentaires ont un coût.

Les lasers proche infrarouge (NIR) utilisés en spectroscopie Raman couvrent généralement une gamme de longueurs d'onde supérieures à 700 nm, telles que 785 nm, 830 nm, 980 nm et 1064 nm. L'intérêt principal de la spectroscopie Raman NIR réside dans la suppression de la fluorescence, mais elle présente plusieurs inconvénients qu'il convient de prendre en compte. Bien que la spectroscopie Raman NIR soit parfois précieuse, elle ne saurait être considérée comme la solution optimale pour tous les échantillons.

Avantages

• La suppression de la fluorescence peut souvent être facilitée par les lasers NIR. La fluorescence est un processus à deux photons, qui nécessite d'abord l'absorption d'un photon, suivie de l'émission d'un photon fluorescent. En revanche, la diffusion Raman est un processus à un photon, qui ne nécessite pas d'absorption. Si de nombreux matériaux absorbent dans le visible, ils sont moins nombreux dans le NIR. Ainsi, dans de nombreux cas, les lasers NIR ne produisent pas de fluorescence (puisqu'il n'y a pas d'absorption), mais la diffusion Raman est présente normalement. Dans les cas où les échantillons sont fortement fluorescents sous excitation visible, la diffusion Raman NIR peut apporter une solution et permettre d'obtenir un bon spectre Raman.

Inconvénients

• Une diminution de la sensibilité peut résulter d'une excitation proche infrarouge, car l'efficacité de la diffusion Raman est proportionnelle à λ^-4, où λ est la longueur d'onde du laser. Ainsi, la diffusion Raman à 785 nm est presque cinq fois moins efficace qu'à 532 nm. Ce problème est aggravé par la diminution de la sensibilité du détecteur CCD dans la gamme Raman proche infrarouge. Par conséquent, les temps de mesure sont souvent considérablement allongés pour obtenir une qualité spectrale similaire à celle des mesures effectuées avec des lasers visibles.
   
• Les lasers NIR présentent souvent des qualités de faisceau (par exemple, largeur et divergence) moins adaptées à la microscopie. De ce fait, la résolution spatiale peut être quelque peu compromise, et les résultats obtenus peuvent donc ne pas correspondre aux prévisions théoriques.

Il existe deux principales classes de filtres utilisés pour la spectroscopie Raman.

Filtres optiques

Ces composants optiques sont placés sur le trajet du faisceau Raman et servent à bloquer sélectivement la raie laser (diffusion Rayleigh) tout en laissant passer la lumière diffusée Raman vers le spectromètre et le détecteur. Chaque longueur d'onde laser nécessite un filtre spécifique. Deux principaux types de filtres sont utilisés, tous deux pouvant être employés sans intervention ni optimisation de l'utilisateur :

• Filtre passe-bas. Un filtre passe-bas est un filtre optique passe-haut qui absorbe toutes les longueurs d'onde jusqu'à une certaine longueur d'onde, puis transmet avec une grande efficacité toutes les longueurs d'onde supérieures à cette longueur d'onde. Par exemple, un filtre passe-bas de 532 nm absorbera toute la lumière jusqu'à 533,5 nm, voire plus (par exemple, 50 cm^-1 et plus), y compris l'émission laser. Au-delà de 533,5 nm, il transmettra la lumière, permettant ainsi la détection du spectre Raman (qui s'étend de 50 cm^-1 à 3500 cm^-1 et plus). Les filtres passe-bas présentent une transition spectrale extrêmement abrupte entre les régions d'absorption et de transmission, et offrent un excellent blocage de la raie laser. L'avantage du filtre passe-bas réside dans sa grande stabilité environnementale et sa durée de vie quasi illimitée.
   
• Filtre coupe-bande holographique. Un filtre coupe-bande présente une absorption étroite et discrète qui, pour la spectroscopie Raman, est choisie pour coïncider avec une longueur d'onde laser spécifique. Typiquement, la largeur de l'absorption est de quelques nanomètres (correspondant à quelques centaines de cm^-1). Par exemple, pour un laser de 532 nm, on choisira un filtre coupe-bande avec une absorption centrale à 532 nm. La raie laser sera absorbée, mais le spectre Raman situé au-dessus sera transmis. Contrairement au filtre coupe-bande, le filtre coupe-bande a une durée de vie limitée et se dégrade avec le temps. Son avantage est qu'il permet d'effectuer des mesures pour la diffusion Raman Stokes et anti-Stokes, ce qui est utile pour certaines mesures spécialisées.
   
• Un spectromètre à filtrage accordable équipé d'un triple monochromateur permet de travailler en mode « double soustraction, spectrographe unique ». Les deux premiers monochromateurs sont utilisés comme une paire intégrale : ils dispersent d'abord la lumière diffusée par effet Rayleigh (laser) et Raman, bloquent physiquement la diffusion Rayleigh, puis recombinent les deux faisceaux. Le troisième spectromètre disperse ensuite la lumière diffusée Raman de manière classique, permettant sa détection. L'avantage de cette configuration réside dans la possibilité de régler le filtre laser à l'infini, et dans la compatibilité de l'instrument avec un nombre quelconque de sources laser. De plus, ses performances de filtrage sont excellentes, autorisant l'analyse Raman jusqu'à 4-5 cm^-1. Cependant, cet instrument requiert une expertise plus poussée que les systèmes à monochromateur unique classiques, et est donc rarement utilisé pour les analyses de routine.

Un CCD (dispositif à couplage de charge) est un détecteur multicanal à base de silicium capable de détecter les rayons UV, visible et proche infrarouge. Utilisé en spectroscopie Raman, il est extrêmement sensible à la lumière (et donc adapté à l'analyse du signal Raman intrinsèquement faible) et permet un fonctionnement multicanal (permettant ainsi de détecter l'intégralité du spectre Raman en une seule acquisition). Les CCD sont largement utilisés, notamment comme capteurs dans les appareils photo numériques, mais les versions destinées à la spectroscopie scientifique sont d'une qualité nettement supérieure pour offrir les meilleures caractéristiques de sensibilité, d'uniformité et de bruit possibles.

Les détecteurs CCD sont généralement des matrices unidimensionnelles (linéaires) ou bidimensionnelles (superficielles) composées de milliers ou de millions d'éléments détecteurs individuels (également appelés pixels). Chaque élément interagit avec la lumière pour accumuler une charge électrique ; plus la lumière est intense et/ou plus l'interaction est longue, plus la charge enregistrée est importante. À la fin de la mesure, l'électronique extrait la charge des éléments, ce qui permet de mesurer la charge de chaque élément.

Dans un spectromètre Raman classique, la lumière diffusée par effet Raman est dispersée par un réseau de diffraction, puis projetée sur le grand axe du capteur CCD. Le premier élément détecte la lumière provenant de la limite inférieure du spectre (en cm^-1), le deuxième élément détecte la lumière provenant de la position spectrale suivante, et ainsi de suite… le dernier élément détecte la lumière provenant de la limite supérieure du spectre (en cm^-1).

Les CCD nécessitent un certain degré de refroidissement pour être adaptés à la spectroscopie de haute qualité. Ce refroidissement est généralement assuré par un refroidissement Peltier (adapté aux températures jusqu'à -90°C) ou par un refroidissement cryogénique à l'azote liquide. La plupart des systèmes Raman utilisent des détecteurs refroidis par effet Peltier, mais pour certaines applications spécialisées, les détecteurs refroidis à l'azote liquide présentent encore des avantages.

Un CCD à multiplication d'électrons (EMCCD) est un type particulier de détecteur CCD, qui utilise les dernières technologies pour améliorer la qualité du spectre en présence de signaux extrêmement faibles. Cette amélioration est particulièrement précieuse lorsque le signal Raman est très faible, car la multiplication des électrons permet d'obtenir un spectre de bonne qualité, contrairement aux CCD classiques où seules quelques caractéristiques les plus puissantes sont à peine visibles au-dessus du bruit. Les avantages du gain EM sont évidents en imagerie spectrale Raman rapide, où les temps d'intégration courts nécessaires produisent souvent des signaux à peine visibles au-dessus du bruit lorsqu'ils sont mesurés avec un CCD classique.

L'EMCCD possède deux registres de lecture sur la puce : un registre conventionnel et un registre multiplicateur d'électrons (EM). Dans le registre EM, les tensions d'horloge utilisées sont plus élevées que pour l'horloge conventionnelle, ce qui permet aux électrons d'acquérir suffisamment d'énergie pour permettre l'ionisation par impact. À ce stade, des électrons supplémentaires sont produits et stockés dans le pixel suivant. La probabilité que les électrons acquièrent suffisamment d'énergie pour permettre l'ionisation par impact (et donc la création d'électrons supplémentaires) est faible, mais le registre de lecture comportant de nombreux éléments, des gains importants sont possibles (jusqu'à environ 1 000 fois). Le principal avantage d'un EMCCD réside dans le fait que l'amplification intervient avant la lecture du signal, ce qui signifie que celui-ci n'est pas limité par le bruit de lecture. Autrement dit, grâce à l'amplification, le signal est élevé bien au-dessus du seuil de bruit, largement déterminé par le bruit de l'électronique de lecture (préamplificateur et convertisseur A/N).

La résolution spectrale est la capacité à décomposer les caractéristiques et les bandes spectrales en leurs composantes distinctes. La résolution spectrale requise par l'analyste ou le chercheur dépend de l'application concernée. Par exemple, les analyses de routine pour l'identification d'échantillons de base nécessitent généralement une résolution faible à moyenne. En revanche, la caractérisation des polymorphes et de la cristallinité requiert souvent une résolution élevée, car ces phénomènes ne présentent que de très subtiles variations dans le spectre Raman, invisibles lors d'une expérience à basse résolution.

La résolution spectrale est un paramètre expérimental important. Une résolution trop faible entraîne une perte d'informations spectrales, empêchant l'identification et la caractérisation correctes de l'échantillon. Une résolution trop élevée peut prolonger le temps de mesure. La définition d'une résolution « trop faible » ou « trop élevée » dépend de l'application et des informations attendues de l'expérience.

Généralement, une résolution faible ou moyenne convient à l'identification chimique de base et à la distinction de différents matériaux. Une résolution plus élevée est nécessaire pour caractériser des caractéristiques spectrales plus subtiles, par exemple des modifications mineures de la forme ou de la position d'un pic. Plusieurs phénomènes chimiques sont à l'origine de ces variations spectrales subtiles :

• Cristallinité : En général, les pics Raman deviennent plus nets et plus intenses lorsqu'un matériau passe d'une structure amorphe à une structure cristalline. La haute résolution spectrale permet de caractériser même de très faibles variations de cristallinité.
   
• Polymorphisme : Les polymorphes sont des matériaux ayant la même formule chimique, mais des formes solides différentes. Leur formule chimique étant identique, leurs profils spectraux Raman globaux sont similaires, mais l'influence de la forme solide sur les vibrations des liaisons individuelles entraîne de subtiles variations du spectre. Il n'est donc pas surprenant d'observer des variations mineures dans la forme et la position des pics tout au long du spectre.
   
• Contrainte/déformation intrinsèque : Certains matériaux (notamment les semi-conducteurs) présentent des variations de leur spectre Raman/photoluminescence lorsqu'ils sont soumis à des contraintes et des déformations. Dans le cas des semi-conducteurs, la contrainte/déformation est soigneusement induite au sein du matériau afin de lui conférer les propriétés semiconductrices et/ou luminescentes nécessaires à son utilisation dans des dispositifs fonctionnels. La spectroscopie Raman est un outil essentiel pour caractériser la contrainte/déformation, mais son effet sur le spectre est souvent subtil ; une haute résolution est donc nécessaire.
   
• Liaison hydrogène : Les faibles interactions intermoléculaires et intramoléculaires provoquées par la liaison hydrogène peuvent provoquer de petits changements dans un spectre Raman et, grâce à sa capacité de résolution élevée, le spectre peut être utilisé pour étudier ces interactions.
   
• Repliement des protéines : La structure primaire d'une protéine aura bien sûr un impact significatif sur les spectres Raman obtenus, mais les structures secondaires et tertiaires, comprenant un repliement localisé et plus étendu, perturbent suffisamment les modes vibrationnels pour affecter le spectre. Là encore, l'effet sera subtil, et seule une analyse à haute résolution permettra de le caractériser.

La résolution spectrale d'un spectromètre Raman dispersif est déterminée par quatre facteurs principaux. Dans les analyses ci-dessous, l'effet de chaque facteur est considéré en supposant que tous les autres facteurs restent inchangés. En pratique, tous ces facteurs peuvent exister sous de nombreuses formes, ce qui rend difficile la comparaison directe des performances et des capacités d'un système.

Distance focale du spectromètre

Plus la distance focale du spectromètre (par exemple, la distance entre le réseau dispersif et le détecteur) est grande, plus sa résolution spectrale est élevée. Les spectromètres Raman classiques ont des distances focales allant de 200 mm (pour une résolution faible à moyenne) à 800 mm et plus (pour une résolution élevée). On oublie parfois qu'un spectromètre à longue focale ne se limite pas à la haute résolution. Avec un choix de réseaux adapté, un spectromètre haute résolution peut fonctionner en basse résolution. Il est ainsi parfaitement adapté aux analyses à basse et moyenne résolution pour le criblage de routine, tout en offrant des analyses haute résolution pour des applications plus spécialisées.

Réseau de diffraction

Plus la densité de rainures du réseau est élevée (généralement mesurée en nombre de rainures par millimètre), plus la résolution spectrale est élevée. Les réseaux typiques utilisés en Raman varient de 300 g/mm (basse résolution) à 1 800 g/mm (haute résolution). Des réseaux plus spécialisés (notamment 2 400 g/mm et 3 600 g/mm) sont également disponibles, mais présentent certaines limites et ne doivent pas être considérés comme polyvalents. L'utilisation de réseaux à densité de rainures plus élevée ne peut être appliquée indéfiniment pour augmenter la résolution spectrale, car ils ont des limites pratiques et physiques fixes liées au spectromètre lui-même. Ainsi, les réseaux offrent une première solution pour améliorer la résolution, mais une fois cette limite atteinte, il est nécessaire de passer à un spectromètre à focale plus longue.

Longueur d'onde du laser

Le pouvoir dispersif d'un couple réseau/spectromètre peut généralement être considéré comme constant en longueur d'onde. Cependant, les spectres Raman utilisent une unité liée à l'énergie (décalage Raman, ou nombre d'onde, cm^-1), ce qui signifie que la résolution spectrale diminue lorsque l'excitation laser passe de l'infrarouge au visible, puis à l'ultraviolet. Par exemple, si un réseau de 600 g/mm est utilisé avec un laser infrarouge, un réseau de 1 200 g/mm ou 1 800 g/mm sera nécessaire avec un laser vert pour obtenir une résolution similaire.

Détecteur

La plupart des systèmes ne disposent que d'un seul détecteur ; l'utilisateur n'a donc pratiquement aucun contrôle sur ce facteur. Il convient toutefois de noter que différents détecteurs peuvent être configurés avec différentes tailles de pixels. Plus le pixel est petit, plus la résolution spectrale est élevée.

Un microscope Raman associe un spectromètre Raman à un microscope optique standard. Le faisceau laser d'excitation est focalisé à travers le microscope pour créer un micro-spot d'un diamètre de l'ordre de 0,5 à 10 µm. Le signal Raman de l'échantillon est collecté sur une zone similaire, puis repasse par le microscope vers le spectromètre où il est analysé afin d'en extraire des informations spectrales.

Le microscope Raman permet de réaliser une spectroscopie Raman avec une résolution spatiale microscopique. Il ouvre ainsi une nouvelle dimension à l'analyse chimique :

• Analyse et identification de particules individuelles avec des dimensions allant jusqu'à 0,5 µm.
• Caractérisation des caractéristiques des échantillons avec des dimensions allant jusqu'à 0,5 µm.
• Localisation et identification des contaminants microscopiques.
• Cartographie Raman (imagerie) des caractéristiques de l'échantillon pour montrer la distribution des composants, avec une résolution spatiale jusqu'à 0,5 µm.
   

Le simple ajout d'un microscope permet d'obtenir une résolution spatiale latérale (XY), mais pas en profondeur (Z). Pour cela, une optique confocale est nécessaire. Plusieurs méthodes sont actuellement utilisées, certaines véritablement confocales, d'autres pseudo-confocales, avec des résultats variables. Pour une conception véritablement confocale (qui intègre une ouverture confocale sténopé entièrement réglable), une résolution en profondeur de l'ordre du micron est possible, permettant l'analyse discrète de couches individuelles d'un échantillon.

Certains microscopes Raman ne sont pas équipés d'optique confocale. Le simple ajout d'un microscope permet d'obtenir une résolution spatiale latérale (XY), mais pas une résolution spatiale en profondeur (Z). Pour cela, une optique confocale est nécessaire. Plusieurs méthodes sont actuellement utilisées, certaines véritablement confocales, d'autres pseudo-confocales, avec des résultats variables. Avec une conception véritablement confocale (qui intègre une ouverture confocale sténopé entièrement réglable), une résolution en profondeur de l'ordre du micron est possible, permettant d'analyser discrètement les couches individuelles d'un échantillon.