Spectre Raman de l'aspirine, temps d'acquisition : 1 s
Le temps d'acquisition dépend de plusieurs facteurs, tels que l'échantillon lui-même, la qualité spectrale souhaitée et le spectromètre Raman utilisé. Cependant, les spectromètres Raman modernes classiques permettent d'obtenir des spectres Raman de bonne qualité en quelques secondes.
Les expériences de cartographie/imagerie Raman, qui acquièrent plusieurs milliers de spectres, prennent plus de temps, et leur durée totale d'acquisition peut généralement être de quelques minutes à plusieurs heures. Cela dépend du nombre de points de données acquis, ainsi que des autres facteurs mentionnés précédemment.
Accessoire MultiWell pour analyses à haut débit
La spectroscopie Raman étant une technique sans contact et non destructive, elle peut être utilisée efficacement pour le criblage et les dosages à haut débit automatisés. Parmi les applications courantes, on trouve l'analyse de liquides/poudres en plaques multipuits, le criblage de cristaux et les dosages de contenu/uniformité de comprimés par transmission Raman.
Les systèmes Raman de criblage à haut débit (HTS) combinent déplacement automatisé des échantillons, dispositifs d'autofocus et procédures automatisées d'acquisition et d'analyse des données pour acquérir séquentiellement les spectres de centaines d'échantillons. Le criblage HTS et les mesures automatisées peuvent même être intégrés à une manipulation robotisée complète, éliminant ainsi le recours à une expertise et à l'intervention d'un opérateur.
Des applications telles que les revêtements en carbone de type diamant (DLC) pour les disques durs d'ordinateur et l'analyse des cristaux et des polymorphes dans le développement de médicaments utilisent désormais la spectroscopie Raman pour le criblage automatisé, ainsi que de nombreuses autres applications qui nécessitent simplement une analyse de routine d'un grand nombre d'échantillons.
La technique Raman étant basée sur la diffusion de la lumière, il est possible de transférer à la fois la lumière d'excitation laser et le signal Raman par des câbles à fibres optiques. Un seul câble transmet le laser à l'échantillon, tandis qu'une autre fibre transmet le signal Raman de l'échantillon à un spectromètre et un système de détection standard. Ces deux câbles sont reliés à une tête de sonde Raman compacte et robuste qui focalise le laser sur l'échantillon et collecte le signal Raman.
La génération actuelle de sondes Raman permet l'échantillonnage à distance, à des centaines de mètres de l'analyseur Raman de base. De plus, plusieurs sondes peuvent être connectées à un seul système d'analyse, offrant ainsi une méthode économique de surveillance de la composition chimique en plusieurs points d'une usine.
Les sondes sont adaptées à une utilisation à hautes températures et pressions. Elles peuvent fonctionner en mode immersion (la tête d'analyse est plongée dans le liquide réactionnel) ou en mode stand-off (l'analyse est réalisée en focalisant le laser à travers une fenêtre transparente dans le réacteur ou la canalisation).
L'analyse Raman à distance peut être utilisée pour :
Spectres de référence Raman et cartes Raman de différents savons industriels.
La méthode Raman est une technique d'analyse chimique non destructive et sans contact, applicable aux analyses in vivo. Elle est généralement réalisée à l'aide d'une sonde Raman compacte et déportée, couplée au spectromètre et au laser par des câbles à fibres optiques flexibles.
Il existe de nombreux exemples d'analyse in vivo, notamment pour l'analyse des effets des cosmétiques et des médicaments topiques sur la peau. Les recherches actuelles portent sur l'application de la spectroscopie Raman in vivo en milieu chirurgical, où elle peut servir d'indicateur immédiat de la santé des tissus.
La spectroscopie Raman est particulièrement adaptée à l'analyse d'échantillons aqueux (notamment les solutions et les matériaux biologiques tels que les tissus et les cellules). L'eau présente une diffusion Raman très faible, généralement bien inférieure à celle des autres matériaux. De plus, le spectre de l'eau est très simple, avec un nombre réduit de pics, ce qui minimise l'interférence avec les pics du soluté.
Ainsi, l'analyse d'un soluté en solution aqueuse est facilement possible, car dans la plupart des cas, l'intensité du pic du soluté sera plus forte que celle de l'eau, même lorsque l'eau est en grand excès.
La taille du spot laser est principalement définie par la longueur d'onde du laser et l'objectif du microscope utilisé. La taille minimale du spot atteignable est limitée par la diffraction, conformément aux lois de la physique et de l'optique.
Diamètre du spot laser = 1,22 λ / NA
Où λ est la longueur d'onde du laser et NA l'ouverture numérique de l'objectif du microscope utilisé. Par exemple, avec un laser de 532 nm et un objectif 0,90/100x, le diamètre théorique du spot sera de 721 nm.
À partir de cette équation, on peut voir que les lasers à longueur d'onde inférieure offrent une résolution spatiale plus élevée (par exemple, un laser bleu à 488 nm aura une taille de spot plus petite qu'un laser infrarouge à 785 nm si le même objectif est utilisé), tout comme les objectifs à NA élevée (par exemple, un objectif 0,90/100x donnera un spot plus petit qu'un objectif 0,55/50x).
Une équation légèrement modifiée donne la résolution spatiale théorique limitée par la diffraction qui est réalisable à l'aide d'un microscope optique :
Résolution spatiale = 0,61 λ / NA
Pour un laser de 532 nm avec un objectif 0,90/100x, cela prédit une résolution spatiale de 361 nm. Cependant, si cette équation est applicable à la microscopie optique standard, les processus optiques mis en œuvre en microscopie Raman sont beaucoup plus complexes. Par exemple, la diffusion des photons laser/Raman et l'interaction avec les interfaces de l'échantillon peuvent réduire cette résolution. Ainsi, la résolution spatiale Raman typique est souvent estimée à environ 1 µm, tandis qu'avec de « bons » échantillons, une résolution spatiale proche de la limite de diffraction peut être atteinte.
Certains systèmes, comme le LabRAM HR, peuvent être configurés avec des optiques adaptatives comme le DuoScan™ qui permettent de créer des spots laser pouvant avoir des dimensions allant jusqu'à 270 x 270 µm2 (selon l'objectif utilisé).
Les microscopes Raman standard sont limités à des tailles de spot de l'ordre de 0,5 à 10 µm (selon la longueur d'onde laser et l'objectif utilisés), en raison du trajet optique du faisceau laser collimaté à travers l'objectif. Si ces petites tailles de spot sont idéales pour l'analyse de caractéristiques microscopiques et offrent une excellente résolution spatiale lorsqu'elles sont combinées à une véritable optique confocale, elles peuvent être limitées pour l'analyse de masse ou macroscopique.
Résolution spatiale d'un microscope Raman : imagerie 3D d'un film de masquage stratifié polymère
La résolution spatiale atteignable est principalement définie par la longueur d'onde du laser et l'objectif du microscope utilisé. La résolution spatiale théorique, limitée par la diffraction, selon les lois de la physique et de l'optique, est définie par l'équation suivante :
Résolution spatiale = 0,61 λ / NA
où λ est la longueur d'onde du laser et NA est l'ouverture numérique de l'objectif du microscope utilisé.
Pour un laser de 532 nm avec un objectif 0,90/100x, cela prédit une résolution spatiale de 361 nm. Cependant, si cette équation est applicable à la microscopie optique standard, les processus optiques mis en œuvre en microscopie Raman sont beaucoup plus complexes. Par exemple, la diffusion des photons laser/Raman et l'interaction avec les interfaces de l'échantillon peuvent réduire cette résolution. Ainsi, la résolution spatiale Raman typique est souvent estimée à environ 1 µm, tandis qu'avec de « bons » échantillons, une résolution spatiale proche de la limite de diffraction peut être atteinte.
À partir de cette équation, on peut voir que les lasers à longueur d'onde inférieure offrent une résolution spatiale plus élevée (par exemple, un laser bleu à 488 nm aura une taille de spot plus petite qu'un laser infrarouge à 785 nm si le même objectif est utilisé), tout comme les objectifs à NA élevé (par exemple, un objectif 0,90/100x donnera un spot plus petit qu'un objectif 0,55/50x).
Résolution spatiale d'un microscope Raman : cartographie Raman des caractéristiques des semi-conducteurs à 250 nm et 350 nm.
Notez que l'équation ci-dessus se rapporte à la résolution spatiale latérale (XY). La résolution spatiale en profondeur (Z) est plus complexe et dépend fortement de la conception confocale du microscope Raman utilisé. Plusieurs méthodes sont actuellement utilisées, certaines véritablement confocales, d'autres pseudo-confocales, avec des résultats variables.
Pour une conception véritablement confocale (intégrant une ouverture confocale sténopé entièrement réglable), une résolution en profondeur de l'ordre de 1 à 2 µm est possible, permettant l'analyse discrète de couches individuelles d'un échantillon. La résolution en profondeur atteignable dépend fortement de la longueur d'onde du laser, de l'objectif du microscope et de la structure de l'échantillon.
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