Autorzy: dr Rajesh Kumar Bhola, Shubham Rastogi,
Thomas Gibelin, Sebastien Raimbault, Christophe Fudaly (2023)
Analiza morfologii krwi (CBC) lub pełnej morfologii krwi (FBC) stanowi kluczowy punkt wyjścia w badaniach przesiewowych, diagnostyce oraz monitorowaniu przebiegu choroby lub terapii. Tradycyjne wskaźniki morfologii krwi (pełna morfologia krwi, CBC) dają obraz aktualnego stanu układu krwiotwórczego. Jednak sama analiza CBC nie pozwala na postawienie ostatecznej diagnozy. Aby uzyskać dokładną diagnozę, konieczne jest połączenie jej wyników z wynikami innych badań z zakresu biochemii, mikrobiologii, elektroforezy białek, immunofenotypowania lub innych badań, a także z obrazem klinicznym i wywiadem pacjenta.
Niemniej jednak informacje uzyskane na podstawie parametrów morfologii krwi dają dobry obraz stanu chorobowego pacjenta i mogą wskazywać na sytuacje krytyczne wymagające podjęcia pilnych decyzji klinicznych i odpowiedniego postępowania. Analiza morfologii krwi obejmuje kilka parametrów; niektóre z nich są zliczane, a inne mierzone lub obliczane. Wśród nich analiza liczby białych krwinek (WBC) jest bardzo przydatna do oceny stanu układu odpornościowego oraz do wykrywania różnego rodzaju infekcji.
Leukocyty, zwane również białymi krwinkami (WBC), to wszystkie komórki układu odpornościowego krążące we krwi obwodowej, które biorą udział zarówno w odporności wrodzonej, jak i nabytej. Chronią one organizm gospodarza przed patogenami lub nieprawidłowymi procesami fizjologicznymi. Badanie różnych składników komórkowych WBC nazywa się rozmazem różnicowym WBC lub DIFF (Differential). W ramach rozmazu różnicowego WBC bada się formy niedojrzałe, nieprawidłowości morfologiczne lub obecność nieoczekiwanych komórek. Parametry związane z analizą DIFF są zawsze podawane zarówno w liczbach bezwzględnych, jak i w wartościach procentowych.
HORIBA Medical Analizatory hematologiczne oferują analizę DIFF obejmującą wszystkie pięć typów leukocytów (limfocyty, monocyty, neutrofile, eozynofile i bazofile). Analiza DIFF obejmuje również komórki niedojrzałe, takie jak niedojrzałe limfocyty (IML), niedojrzałe monocyty (IMM) i niedojrzałe granulocyty (IMG).
Limfocyty dzielą się na dwie populacje: komórki B i komórki T. Komórki B wytwarzają przeciwciała, które służą do zwalczania atakujących bakterii, wirusów i toksyn. Komórki T niszczą własne komórki organizmu, które zostały opanowane przez wirusy lub uległy transformacji nowotworowej 1. Monocyt to komórka, która różnicuje się w populacje makrofagów i komórek dendrytycznych w celu regulacji homeostazy komórkowej, zwłaszcza w przypadku infekcji i stanów zapalnych2.
Neutrofile są najliczniejszymi leukocytami we krwi krążącej, a te krótkotrwałe komórki odgrywają kluczową rolę w obronie immunologicznej przed infekcjami bakteryjnymi. Eozynofile odpowiadają za zwalczanie pasożytów wielokomórkowych oraz niektórych infekcji. Kontrolują one również mechanizmy związane z alergiami i astmą. Bazofile odpowiadają za reakcje zapalne zachodzące w trakcie odpowiedzi immunologicznej, wytwarzając związki takie jak histamina i serotonina, które wywołują stan zapalny, ale także heparynę, która zapobiega krzepnięciu krwi. Mogą one brać udział w przebiegu ostrych i przewlekłych chorób alergicznych.
Populacje te, z wyjątkiem bazofilów, można łatwo uwidocznić na macierzy LMNE analizatorów hematologicznych firmy Yumizen (rysunek 1). Na tej macierzy ekstynkcja optyczna (oś Y) jest przedstawiona w funkcji objętości (oś X), tworząc wykres z kilkoma skupiskami komórek. Z macierzy LMNE wyprowadza się dwa dodatkowe parametry: limfocyty atypowe (ALY) oraz duże komórki niedojrzałe (LIC), przy czym ta ostatnia grupa obejmuje odpowiednio strefy niedojrzałych komórek limfocytarnych, granulocytarnych i monocytarnych.
Rysunek 1: Macierz LMNE i nazwy odpowiadających jej stref
Układ odpornościowy składa się z trzech rodzajów komórek granulocytowych: eozynofili, bazofili i neutrofili. Komórki te powstają w wyniku sześciostopniowego procesu różnicowania w szpiku kostnym, zwanego granulopoezą. Pierwszą rozpoznawalną komórką w tym procesie różnicowania jest mieloblast. Kolejne etapy różnicowania to kolejno: promielocyty, mielocyty, metamielocyty i komórki prążkowane (ryc. 2).
Rycina 2: Zdjęcia mikroskopowe komórek linii neutrofilowej na każdym etapie granulopoezy
Niedojrzałe granulocyty reprezentują trzy populacje komórek: promielocyty, mielocyty i metamielocyty.
W warunkach fizjologicznych komórki te nie występują we krwi obwodowej, z wyjątkiem noworodków, a ich znaczna liczba powinna skłonić do przeprowadzenia dalszych badań. Rzeczywiście, w niektórych przypadkach można zaobserwować wysoką liczbę niedojrzałych granulocytów we krwi obwodowej, zjawisko to nazywane jest również „przesunięciem w lewo”. Zazwyczaj odzwierciedla to zwiększoną produkcję komórek szpikowych w stanach patologicznych, takimi jak infekcja zapalna, ciężka choroba hematologiczna, nowotwór, martwica tkanek, ostre odrzucenie przeszczepu, uraz chirurgiczny lub ortopedyczny, choroby mieloproliferacyjne, stosowanie steroidów, a także ciąża³.
Do tej pory liczenie pod mikroskopem było przez długi czas jedyną metodą analizy niedojrzałych granulocytów. Badanie wybarwionego rozmazu krwi pozwala obliczyć odsetek niedojrzałych granulocytów oraz wykryć wiele nieprawidłowości morfologicznych. Mikroskopia cyfrowa (CellaVision) pozwala zaoszczędzić czas potrzebny na ocenę preparatów, jednak ze względu na niedoskonałość oprogramowania klasyfikującego nadal konieczna jest kontrola przez operatora w celu sprawdzenia i skorygowania błędnie sklasyfikowanych komórek, dlatego obecnie zliczanie leukocytów odbywa się za pomocą automatycznych analizatorów.
Wreszcie, oznaczenie IMG można wykonać za pomocą wielokolorowej cytometrii przepływowej z użyciem barwników lub przeciwciał do znakowania. Można to osiągnąć, celując w ekspresję CD45, CD11b, CD15 i CD16, ponieważ ich ekspresja różni się na każdym etapie różnicowania granulopoezy. Cytometria przepływowa jest jednak kosztowna i wymaga doświadczonych specjalistów, którzy nie są dostępni 24 godziny na dobę, dlatego jest wykorzystywana głównie do dalszej diagnostyki w przypadku podejrzenia hemopatii.
Badania wskazują, że ręczne metody mikroskopowe nie pozwalają na dokładne i precyzyjne liczenie, ponieważ stale niedoszacowują niedojrzałych granulocytów przy niskich wynikach3. Zautomatyzowane liczenie metodą cytometrii przepływowej można uznać za metodę referencyjną, ponieważ jest ona lepsza od ręcznego mikroskopowego liczenia morfologicznego4.
HORIBA Medical Analizatory hematologiczne oferują parametr o nazwie „Niedojrzałe granulocyty” (IMG), który zapewnia pełne uwzględnienie populacji niedojrzałych granulocytów podczas wykonywania morfologii krwi. Parametr IMG pozwala laboratoriom klinicznym na szybsze i bardziej specyficzne wykrywanie nieprawidłowych komórek we krwi obwodowej. Populację niedojrzałych granulocytów można łatwo rozróżnić na matrycy LMNE dzięki ciemnozielonym kropkom (rysunek 3).
Rysunek 3: Strefa IMG na matrycy LMNE
Zasada wykrywania komórek IMG opiera się na cytometrii przepływowej z wykorzystaniem podwójnego hydrodynamicznego systemu sekwencyjnego (DHSS). Komórki są wykrywane, zliczane i mierzone przy użyciu kombinacji impedancji i ekstynkcji optycznej. Niedojrzałe granulocyty charakteryzują się wysokim potencjałem rozpraszania światła (złożona zawartość wewnątrzkomórkowa). Niedojrzałe komórki granulocytowe (IMG) są wykrywane na podstawie ich większej objętości oraz zwiększonej ilości ziarnistości, co jest wykrywane za pomocą technologii ekstynkcji optycznej. Progi populacji komórek (niektóre z nich ruchome, a inne stałe) określają granice normy dla prawidłowych morfologii leukocytów.
Zmiany w morfologii konkretnej populacji są zaznaczone w macierzy poprzez przesunięcie odpowiadającej jej populacji. W publikacji „HORIBA Medical” podjęto próbę wzbogacenia tych dodatkowych informacji dostarczanych przez analizator poprzez określenie przedziału referencyjnego dla danej populacji (tabela 1).
Tabela 1: Tabela zakresów norm dla parametru IMG na podstawie badania HORIBA Medical
Te zakresy norm zostały określone na podstawie badania 240 próbek krwi (120 mężczyzn i 120 kobiet w wieku powyżej 18 lat) pochodzących z populacji francuskiej, które zostały zbadane dwukrotnie na jednym urządzeniu Yumizen H1500 oraz dwóch urządzeniach Yumizen H2500 zgodnie z wytycznymi CLSI C28-A3.6 Pobieranie próbek od mężczyzn i kobiet przeprowadzono z użyciem antykoagulantu EDTA.
Próbki przechowywano w temperaturze pokojowej od momentu pobrania do przeprowadzenia badania. Te zakresy norm będą się różnić w zależności od badanej populacji i/lub położenia geograficznego. Stowarzyszenie HORIBA Medical zdecydowanie zaleca, aby każde laboratorium ustaliło własne zakresy norm w oparciu o lokalną populację.
Ocena tych zakresów normy umożliwiła zainstalowanie w systemie alarmów uruchamiających się w przypadku przekroczenia tych wartości. Matryca LMNE (Yumizen) pozwala na wizualną prezentację sytuacji charakteryzujących się wysokim i niskim poziomem IMG (rysunek 4).
Rysunek 4: Niski poziom IMG (po lewej) w porównaniu z wysokim poziomem IMG (po prawej) z matrycy HORIBA Yumizen LMNE
Automatyczne liczenie niedojrzałych granulocytów wzbudza duże zainteresowanie kliniczne w kontekście leczenia chorób oraz poprawy wyników klinicznych pacjentów. IMG pełni rolę biomarkera hematologicznego, który pomaga określić stopień ciężkości zakażenia oraz ryzyko sepsy u pacjentów nie tylko na oddziale ratunkowym, ale także u pacjentów wykazujących wczesne objawy zakażeń i/lub zaburzeń szpiku kostnego w gabinetach lekarskich.
Zgodnie z wynikami badania⁷ liczba niedojrzałych granulocytów stanowi wczesny marker pozwalający na rozpoznanie ostrego zapalenia wyrostka robaczkowego (AA). AA jest najczęstszą przyczyną bólu brzucha, którą leczy się za pomocą zabiegu chirurgicznego zwanego appendektomią. Wyróżnia się dwa typy AA: proste zapalenie wyrostka robaczkowego (SA) bez powikłań oraz powikłane zapalenie wyrostka robaczkowego (CA) z ryzykiem powikłań pooperacyjnych. Wczesne rozróżnienie między SA a CA ma zasadnicze znaczenie dla zastosowania odpowiedniego leczenia, co pozwala zmniejszyć wskaźniki powikłań pooperacyjnych oraz koszty leczenia.
Niestety, obecnie stosowane biomarkery, takie jak stosunek neutrofili do limfocytów (NLR), poziom białka C-reaktywnego lub poziom bilirubiny, nie pozwalają na odróżnienie CA od SA.
W tym badaniu Yılmaz Ünal odkrył, że odsetek niedojrzałych granulocytów może służyć do rozróżniania CA i SA, a ich liczba bezwzględna—do odróżniania AA od normalnego zapalenia wyrostka robaczkowego.7
W innym badaniu⁸ Güngör i wsp. stwierdzili, że liczba niedojrzałych granulocytów stanowi odpowiedni marker pozwalający przewidzieć wystąpienie ciężkiej infekcji bakteryjnej (SBI) oraz jej nasilenie na oddziałach pediatrycznych. Stawka jest naprawdę wysoka – SBI może stanowić zagrożenie dla życia dzieci z zapaleniem opon mózgowych lub zakażeniem dróg moczowych. Do tej pory do diagnozy wykorzystywano takie ważne biomarkery, jak białko C-reaktywne (CRP) czy bezwzględna liczba neutrofili (ANC).
Jednak automatyczna metoda IMG jest szybsza, tańsza, mniej pracochłonna i nie wymaga dodatkowego pobrania krwi. W badaniu stwierdzono, że średni odsetek niedojrzałych granulocytów był wyższy u pacjentów z SBI w porównaniu z pacjentami bez SBI⁸.
Van der Geest i in. wykazali, że oprócz przydatności na oddziałach pediatrycznych, prognozowanie inwazyjności i ciężkości zakażenia bakteryjnego u pacjenta w stanie krytycznym hospitalizowanego na oddziale intensywnej terapii można ocenić przy użyciu liczby niedojrzałych granulocytów9.
Liczba niedojrzałych granulocytów stanowi przydatny wskaźnik pozwalający przewidzieć stan zapalny. Karakulak i in. wykazali, że nasilenie oraz śmiertelność szpitalna ostre zapalenie trzustki (AP) może wiązać się z wysokim odsetkiem niedojrzałych granulocytów 10. Stwierdzono, że odsetek niedojrzałych granulocytów u pacjentów w momencie przyjęcia do szpitala był wyższy w przypadkach ciężkiego zapalenia trzustki oraz zgonów szpitalnych w porównaniu z pacjentami z łagodnym i umiarkowanym przebiegiem choroby. Wczesna diagnoza ma kluczowe znaczenie dla zastosowania odpowiedniego leczenia, ponieważ 1% pacjentów z zapaleniem trzustki umiera już w momencie przyjęcia do szpitala.
Ponadto w innym badaniu 11 W pracy autorstwa Huanga i in. stwierdzono, że „AP uznano za jeden z powszechnych czynników wywołujących występowanie „zespół ostrej niewydolności oddechowej” (ARDS). W ten sposób wykazali oni również, że odsetek niedojrzałych granulocytów stanowi użyteczny biomarker pozwalający na szybką identyfikację pacjentów z AP, u których występuje wysokie ryzyko wystąpienia ARDS we wczesnych stadiach choroby w momencie przyjęcia do szpitala 11.
Wreszcie badanie przeprowadzone przez Ayresa i wsp. 12 wykazało, że odsetek niedojrzałych granulocytów pozwala wykluczyć sepsę, gdy wynosi on <2% we wczesnym stadium choroby. Sepsa to zespół kliniczny charakteryzujący się zagrażającą życiu dysfunkcją narządów, spowodowaną zaburzoną reakcją na infekcję13. Sepsa charakteryzuje się nawet dziesięciokrotnym wzrostem liczby niedojrzałych neutrofili w krwiobiegu, co zwykle określa się mianem „przesunięcia w lewo”. Zgodnie z tym artykułem sepsa jest najczęstszą przyczyną zgonów na oddziałach intensywnej terapii, co sprawia, że jej wczesna diagnoza jest niezbędna do zastosowania odpowiedniej antybiotykoterapii. Posiew krwi jest metodą „złotego standardu”, ale jest droższy i bardziej czasochłonny w porównaniu z liczeniem niedojrzałych granulocytów (IMG) ¹².
W oddziale intensywnej terapii noworodków wczesna sepsa (EOS) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności, zgodnie z artykułem Cimenti i in. 14. W badaniu stwierdzają, że „znacznie wyższy odsetek niedojrzałych granulocytów obserwowano u noworodków zakażonych w porównaniu do niezakażonych oraz u noworodków z dodatnimi w porównaniu do ujemnych posiewami krwi” 14. Ponadto badanie to wykazało, że zautomatyzowane liczenie IMG może zastąpić „złoty standard” w diagnostyce zakażenia sepsą noworodków 5.
Automatyczne liczenie niedojrzałych granulocytów dostarcza przydatnych informacji do diagnozowania wczesnej sepsy u noworodków.
Wprowadzenie różnicowej analizy białych krwinek z wykorzystaniem połączenia technologii impedancji i ekstynkcji optycznej umożliwiło wykrywanie nieprawidłowych leukocytów we krwi obwodowej.
Dzięki parametrowi IMG, analizatory Yumizen mogą sygnalizować nieprawidłowe poziomy niedojrzałych granulocytów w próbkach pacjentów. Badania wykazały silną korelację między zautomatyzowanym pomiarem niedojrzałych granulocytów a złotymi standardami, takimi jak ręczne liczenie pod mikroskopem. Badania potwierdziły również kliniczną użyteczność tego parametru i technologii w diagnostyce i leczeniu wielu chorób.
Pomiar liczby niedojrzałych granulocytów z wykorzystaniem parametru IMG jest dokładny, wiarygodny i można go uzyskać szybko, bez dodatkowych odczynników, pobierania krwi i bez wymiany sprzętu HORIBA Medical. Wartości IMG można uzyskać bez dodatkowych kosztów w przypadku rozmazu krwinek białych.
Automatyzacja badań hematologicznych
Analizator hematologiczny 3 diff
Masz pytania lub prośby? Skorzystaj z tego formularza, aby skontaktować się z naszymi specjalistami.
