O tamanho importa nos sistemas de administração de vacinas. Nanopartículas menores que 200 nm geralmente apresentam uma resposta imunogênica maior do que micropartículas maiores que 1 mícron. Essa afirmação, bastante simples, baseia-se no entendimento comum de que partículas com tamanhos semelhantes às dimensões dos vírus são tratadas como vírus pelo organismo. No caso da fabricação da nova vacina contra a COVID-19, adenovírus com tamanho semelhante ao do SARS-CoV-2 (mediana de aproximadamente 90-100 nanômetros) são manipulados como carreadores (ou vetores virais) para desencadear a produção de proteínas spike. Em contrapartida, a literatura publicada demonstra que o efeito de vacinas administradas por via oral, intranasal ou por outras superfícies mucosas favorece formulações microparticuladas em relação às nanoparticuladas, devido à maior carga antigênica. O tamanho das impurezas também afeta significativamente a eficácia da vacina. Em suma, muitos ingredientes de formulações de vacinas devem ter tamanho, distribuição de tamanho e quantidade de partículas controlados ao longo de todo o processo de desenvolvimento, fabricação, armazenamento e administração.
O processo inicial de preparação de vacinas exige uma caracterização cuidadosa do vírus para alcançar infectividade e estabilidade otimizadas. Os títulos infecciosos são usados para determinar a concentração de partículas virais capazes de transduzir células e sua carga viral em uma amostra. Duas técnicas analíticas consagradas para medir títulos infecciosos são:
Ambas as abordagens quantificam a quantidade de vírus presente em uma solução. O ensaio de placas virais para lentivírus, por exemplo, requer até duas semanas de incubação para determinar o resultado em Unidades Formadoras de Placas (UFP) por mL. A contagem de UFP também é subjetiva, resultando em baixa reprodutibilidade entre diferentes analistas. A qPCR, por outro lado, não discrimina entre vírus inteiros, fragmentados, vazios, agregados, infecciosos ou não infecciosos; ela apenas determina a expressão gênica viral relativa e correlaciona o valor com as UFP. A desvantagem é que a qPCR requer conhecimento prévio da sequência do genoma viral, pode ser dispendiosa e analisa a concentração de material genômico, não de vírus infecciosos, uma vez que RNA ou DNA não revestidos podem estar presentes em uma amostra, mas, sem o revestimento, são incapazes de entrar em uma célula.
Figura 1: Resultado da medição de uma amostra de vetor viral humano. Observe a distribuição que exibe a presença tanto de detritos celulares do hospedeiro quanto de agregados.
Os resultados da análise de concentração de partículas obtidos com o sistema de rastreamento de nanopartículas (NTA) multilaser ViewSizer 3000™ correlacionam-se com as Unidades Formadoras de Placa (UFP), de forma semelhante à qPCR. Graças à operação simultânea de três lasers, o sistema quantifica não apenas as partículas virais intactas, mas também os agregados infecciosos. A Figura 1 demonstra a distribuição de tamanho das partículas de uma amostra de vetor viral humano, um vírus candidato utilizado na fabricação de vacinas. Observe a população significativa de partículas maiores.
Baixe a Nota Aplicação 227: Obtendo Título Infeccioso com Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA) com múltiplos lasers
A capacidade de analisar eficazmente toda a gama de tamanhos permite ao ViewSizer 3000 correlacionar com sucesso o título infeccioso conhecido com a concentração total de partículas, com um valor R² superior a 0,9, comprovando que a técnica NTA multi-laser é uma alternativa nova, económica e eficiente em termos de tempo, em comparação com a VPA e a qPCR.
Assista ao webinar sob demanda: Concentração e tamanho de vírus e partículas semelhantes a vírus.
Figura 2: Correlação do título infeccioso.
Partículas semelhantes a vírus (VLPs, na sigla em inglês) são projetadas para imitar o vírus de interesse e provocar um efeito terapêutico (como imunidade) sem o custo do vírus ou o risco de infecção. Elas têm sido o foco de inúmeras pesquisas sobre vacinas inovadoras. O tamanho das VLPs é semelhante ao dos vírus, que normalmente varia de algumas dezenas a algumas centenas de nanômetros. Além da técnica NTA multilaser ViewSizer 3000, o analisador de tamanho de partículas por difração a laser LA-960V2 também é adequado para a análise de VLPs. A difração a laser é uma técnica de conjunto que permite análises rápidas e rotineiras. A técnica também é fundamentalmente mais sensível a partículas maiores, como contaminantes. Dependendo de como a VLP é fabricada, fragmentos do material inicial provavelmente estarão presentes na amostra em tamanhos maiores do que a própria VLP. Isso ocorre quando materiais (como emulsões) são preparados com uma distribuição de tamanho ampla e, em seguida, o tamanho é reduzido para produzir um produto final. Partículas grandes remanescentes podem levar a uma resposta imune indesejada ou a problemas de filtração em processamentos subsequentes (como a esterilização por filtração). Para analisar vírus e VLPs, é essencial uma técnica que abranja uma ampla faixa dinâmica de partículas.
Um exemplo de resultado de tamanho (abaixo da Figura 3) mostra três populações distintas. A população mais fina (menor tamanho de partícula) é a própria VLP. As populações restantes (com diâmetros acima de cerca de 1 mícron) são o material inicial que ainda não foi triturado ou moído para tamanhos mais finos. O LA-960V2 pode fornecer métricas de tamanho para toda a população, bem como métricas para cada população individual, usando o Relatório Multimodal.
Figura 3: Distribuição do tamanho de partículas e resultados para um material VLP medido pelo LA-960. Esta amostra mostra três populações distintas. A população mais fina (menor tamanho de partícula) é o próprio VLP. As populações restantes (com diâmetros acima de cerca de 1 mícron) são material inicial que ainda não foi cisalhado ou moído para tamanhos mais finos.
Assista ao webinar sob demanda: [Universidade de Maryland] Injeção intralinfática de depósitos de liberação controlada para potencializar a vacinação e modular a resposta imune.
Um subgrupo de vesículas extracelulares (VE) conhecidas como exossomos desempenha um papel cada vez mais importante e complexo no diagnóstico e tratamento de diversas doenças. São responsáveis pela transferência de material genético e pela comunicação intercelular, transportando diversos ácidos nucleicos, incluindo RNA, lipídios e proteínas. Suas propriedades imunogênicas, segundo diversos estudos publicados, correlacionam-se com a quantidade de antígenos associados, criando, assim, uma oportunidade para o desenvolvimento de potenciais vacinas.
O tamanho e a concentração das partículas de exossomos são especialmente analisados, pois fornecem informações clínicas importantes. Até o momento, no entanto, a pesquisa sobre vesículas extracelulares (VEs) ainda carece de padronização para o processo de purificação. Além disso, tem sido limitada pelas tecnologias analíticas utilizadas para medi-las. Sabe-se, porém, que as VEs são um grupo heterogêneo de partículas com uma variedade de tamanhos e biogênese; espera-se que a distribuição de tamanho seja ampla, mesmo após o processamento.
Assista ao webinar sob demanda: Exossomos: Explorando o Potencial Diagnóstico e Terapêutico das Nanopartículas Biológicas da Natureza
O ViewSizer 3000 possui três lasers operando simultaneamente em 635 nm (vermelho), 520 nm (verde) e 445 nm (azul), além de uma câmera colorida para visualizar com precisão partículas de grande faixa dinâmica. Ele supera a desvantagem comum da NTA convencional, que é a dificuldade em dimensionar partículas com precisão em amostras polidispersas. Amostras de exossomos de pré-adipócitos humanos (células-tronco mesenquimais) (100 µg) adquiridas da ZenBio foram analisadas utilizando o ViewSizer 3000. O resultado foi validado por uma técnica de sensoriamento resistivo ajustável e apresentou um perfil com diâmetro de partícula D50 de 148 nm e concentração total de partículas de 5,7 x 10⁷ partículas/mL.
Figura 4: Distribuição do tamanho e da concentração das partículas de exossomos.
Baixe a Nota Aplicação 218: Distribuição do Tamanho de Partículas e Concentração de Exossomos
Vírus, VLPs (como adjuvantes) e exossomos podem ser analisados quanto ao tamanho e concentração usando um instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) com múltiplos lasers, o ViewSizer 3000. A maioria das amostras apresenta uma ampla distribuição de tamanho que dificulta a análise NTA com um único laser. Se apenas a distribuição de tamanho for necessária, como em um processo de redução de tamanho, a difração a laser também se mostrou útil.
Análise simultânea de rastreamento de nanopartículas multiespectrais (NTA)
Analisador de Distribuição de Tamanho de Partículas por Dispersão de Laser
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