Técnicas de fluorescência em estado estacionário

Como a intensidade da fluorescência depende da concentração da molécula fluorescente, curvas de concentração padrão podem ser geradas facilmente e usadas para determinar as concentrações da mesma molécula em amostras desconhecidas.

Isso é útil em experimentos de supressão de fluorescência, nos quais aditivos diminuem a intensidade dos fluoróforos de forma sistemática. Curvas de concentração também podem ser criadas para estudar como outras moléculas interagem com estruturas como proteínas, e podem ser usadas para rastrear sistematicamente mudanças estruturais, enovelamento, desenovelamento, associação e dissociação de proteínas.

Como exemplo de um experimento de fluorescência em ponto único, apresentamos aqui uma curva de calibração de um conjunto conhecido de microesferas fluorescentes. Cinco soluções com concentrações conhecidas foram utilizadas para criar a curva padrão. A curva foi ajustada a um polinômio linear e o ajuste foi utilizado para calcular a concentração de microesferas em uma solução desconhecida.

A temperatura influencia a intensidade da fluorescência e, por vezes, também o comprimento de onda e a forma do espectro. O coeficiente de extinção molar (ou constante de taxa radiativa) de um emissor fluorescente geralmente apresenta uma fraca dependência da temperatura. No entanto, a constante de taxa não radiativa, que é governada pelo acoplamento vibracional, é fortemente afetada e aumenta com o aumento da temperatura. Isso significa que, em geral, a fluorescência diminui com o aumento da temperatura. Da mesma forma, o quenching colisional também aumenta com a temperatura, diminuindo também a intensidade da fluorescência.

A fluorescência é fortemente influenciada pelas moléculas ao redor da molécula emissora. Além disso, fluoróforos medidos em temperaturas muito baixas, utilizando nitrogênio líquido ou hélio líquido, apresentam fluorescência aumentada, bem como maior quantidade de estrutura vibracional nos espectros de excitação e emissão. O quenching colisional diminui e a constante de taxa não radiativa também diminui, aumentando a intensidade da emissão de fluorescência.

Moléculas como hidrocarbonetos poliaromáticos (por exemplo, antraceno, naftaleno, pireno, perileno, etc.) apresentam picos vibracionais visíveis no espectro à temperatura ambiente. À temperatura do nitrogênio líquido (77 K), esses picos de fluorescência tornam-se mais estruturados e os picos de fosforescência tornam-se mensuráveis. Os espectros abaixo foram medidos a 298 K e a 77 K em um acessório de amostragem Dewar de nitrogênio líquido.

Os picos Raman frequentemente aparecem em um espectro de fluorescência, especialmente se a intensidade da fluorescência for fraca. Para remover um pico Raman, o espectro de um solvente em branco pode ser medido nas mesmas condições da amostra e esse espectro "em branco" subtraído do espectro de fluorescência da amostra. Como um pico Raman é um fenômeno vibracional relacionado à energia da luz de excitação, sua posição pode ser controlada até certo ponto. Um pico Raman se aproximará ou se afastará do comprimento de onda de excitação se a excitação for deslocada para o azul ou para o vermelho, respectivamente. Portanto, se um pico Raman estiver interferindo no espectro de fluorescência de uma amostra, o comprimento de onda de excitação pode ser ajustado para posicionar o pico Raman em uma posição ligeiramente diferente, se necessário.

Os espectros de fluorescência também podem ser usados para rastrear alterações no enovelamento ou desenovelamento de proteínas. Este é um exemplo de como o espectro de fluorescência do triptofano em uma solução de 1 μM de BSA se comporta com o aumento da temperatura. Essas curvas representam a variação da temperatura de 5 a 70 °C. É possível observar a diminuição da intensidade, bem como o deslocamento do espectro para comprimentos de onda mais curtos, à medida que a temperatura aumenta. A anisotropia, ou anisotropia resolvida no tempo, também pode ser usada para obter informações sobre o tamanho, a forma e o movimento de orientação da proteína.