O que é a espectroscopia A-TEEM?

A espectroscopia A-TEEM refere-se à capacidade de adquirir simultaneamente dados de Absorbância, Transmitância e uma Matriz de Excitação-Emissão de Fluorescência (A-TEEM) de uma determinada amostra. A HORIBA foi pioneira nessa técnica com os sistemas patenteados Aqualog e Duetta, que combinam a espectroscopia A-TEEM com a detecção simultânea por CCD multicanal para fornecer resultados extremamente rápidos.

Os espectrômetros A-TEEM podem ser usados para obtenção de espectros de fluorescência (EEMs) ou para medições de absorbância em análises multicomponentes, mas seu verdadeiro poder reside no fato de que os EEMs coletados pelo instrumento são corrigidos para o efeito de filtro interno. Isso significa que eles representam de forma fiel e precisa as moléculas de interesse em uma faixa de concentração muito mais ampla e útil (tipicamente até ~2 unidades de absorbância). Portanto, esses EEMs permitem uma identificação muito mais precisa do que é possível com um EEM coletado de um fluorímetro de varredura tradicional. A espectroscopia A-TEEM está levando a técnica de fluorescência para o mercado analítico e já foi demonstrado que ela pode, em alguns casos, substituir instrumentos tradicionais como HPLC ou espectrômetro de massas, tornando-se uma ferramenta analítica mais simples, rápida e econômica.

Para acessar o verdadeiro potencial da espectroscopia de fluorescência A-TEEM, é necessário empregar métodos de software multivariados, como Análise de Componentes Principais (PCA), Método dos Mínimos Quadrados Clássicos (CLS) e Análise de Fatores Paralelos (PARAFAC).

A maioria dos componentes da matéria orgânica dissolvida cromofórica (CDOM) apresenta amplos espectros de excitação e emissão de fluorescência sobrepostos nas faixas do ultravioleta e do visível. Diversas medições de amostras são utilizadas para criar um modelo, e a quimiometria é então empregada para obter pontuações de cada componente em uma amostra individual. O diferencial do espectro de excitação-emissão de fluorescência (EEM) é sua capacidade de funcionar como uma impressão digital molecular. Alterações no espectro de emissão, no espectro de excitação ou em ambos podem ser facilmente rastreadas utilizando esse método de fluorescência tridimensional para análise de água, bem como para diversas outras aplicações.

Uma aplicação comum para EEMs, e especialmente para a espectroscopia A-TEEM é a análise da qualidade da água, especificamente para o estudo da matéria orgânica dissolvida cromofórica, também chamada de CDOM. A matéria orgânica dissolvida inclui aminoácidos, ácidos húmicos, ácidos fúlvicos e outros exemplos de matéria decomposta em fontes de água naturais ou subprodutos da desinfecção em processos de tratamento de água. As A-TEEMs são usadas para identificar a presença de cada um deles em concentrações muito baixas, tipicamente na faixa de ppb.

A maioria dos componentes da matéria orgânica dissolvida cromofórica (CDOM) apresenta amplos espectros de excitação e emissão de fluorescência sobrepostos nas faixas do ultravioleta e do visível. Diversas medições de amostras são utilizadas para criar um modelo, e a quimiometria é então empregada para obter pontuações de cada componente em uma amostra individual. O diferencial do espectro de excitação de fluorescência (EEM), corrigido para o efeito de filtro interno (IFE), reside na sua capacidade de funcionar como uma impressão digital molecular precisa. Alterações no espectro de emissão, no espectro de excitação ou em ambos podem ser facilmente rastreadas utilizando este método de fluorescência 3D para análise da água.

Os espectros de fluorescência de excitação-emissão (EEM) também são usados para estudar produtos petroquímicos, medicamentos, proteínas e ciência de alimentos, incluindo vinho, cerveja e muitas outras bebidas. Abaixo, um exemplo de uma amostra de vinho italiano medida antes e depois de um tratamento de oxidação de uma semana (exposição ao ar). O EEM e os espectros de absorbância correspondentes fornecem uma impressão digital do vinho, mostrando alterações na forma e intensidade do espectro de fluorescência para componentes como ácido cafeico, flavonóis, epicatequina, ácido gentísico e antocianinas.

Utilizando análise quimiométrica, os EEMs individuais também são usados para caracterizar nanotubos de carbono de parede simples. (Nota de aplicação da HORIBA: Espectros de fluorescência de nanotubos de carbono com o Nanolog, s.d.) O nanotubo de carbono, que é uma folha de grafeno enrolada, pode ser de parede simples ou de paredes múltiplas (múltiplas folhas enroladas). (Dresselhaus, 2000) (O'Connell, 2002) Somente os nanotubos de carbono de parede simples (SWCNTs) emitem fótons devido às suas propriedades semicondutoras.

O ângulo de dobramento helicoidal também afeta os comprimentos de onda de absorção e emissão do nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT). (Bachilo, 2002) Dependendo se a folha de grafeno é enrolada horizontalmente ou em um ângulo, a estrutura do carbono difere. A geometria específica pode ser descrita em termos do vetor de enrolamento contendo o comprimento (a circunferência do tubo) e um ângulo de hélice α (variando de 0 a 30°), e assim os dois números (n, m) são usados para a definição do SWCNT. O ângulo de hélice em termos de (n, m) é:

No caso dos SWCNTs, o semicondutor absorve entre os níveis de energia c2 e v2, onde o buraco de elétron é transferido, como mostrado na Fig. 34. Um fóton é emitido na banda proibida, ou nível de energia c1-v1. Essas bandas de condução e emissão dependem do diâmetro de um nanotubo de carbono, que também pode ser descrito como raio de Bohr do excíton. Quanto menor o raio, maior a energia (ou menores os comprimentos de onda) da luz absorvida e emitida. Isso se deve ao efeito de confinamento quântico, que determina que o comprimento de onda da luz emitida é limitado pelo tamanho da partícula ou, neste caso, pelo diâmetro do tubo. (O'Connell, 2002) (Dresselhaus, 2000)

Com o aumento da produção de proteínas utilizando cultura de células de mamíferos, tornou-se cada vez mais importante controlar a qualidade dos meios de cultura celular utilizados nos processos de produção.

Os meios de cultura celular são geralmente preparados como soluções aquosas e devem fornecer tudo o que uma linhagem celular precisa para o crescimento celular ideal, bem como para o rendimento e a qualidade do produto.

Em qualquer processo de biorreator, é crucial identificar o tipo adequado de meio de cultura celular e sua qualidade, pois mesmo variações sutis na composição podem ter um impacto significativo na taxa de crescimento da cultura celular e em seu rendimento. Portanto, a composição e a qualidade dos meios de cultura celular em biorreatores devem ser rigorosamente controladas para manter um processo otimizado. Consequentemente, métodos para identificar e analisar a qualidade dos meios de cultura celular tornaram-se um foco importante nesta área.

Uma varredura síncrona ocorre quando o monocromador de excitação realiza a varredura simultaneamente com o monocromador de emissão, e a emissão de fluorescência é lida. Normalmente, é possível definir um deslocamento entre os monocromadores de excitação e emissão que corresponda ao deslocamento de Stokes (diferença entre os picos de excitação e emissão). Esses tipos de varreduras síncronas têm sido historicamente usados para análise de componentes, mas, devido aos instrumentos mais modernos para medição de espectros de emissão de elétrons (EEMs) com detectores CCD, o EEM fornece mais informações no mesmo tempo de aquisição.

Um deslocamento de 0 nm pode ser definido para que a excitação e a emissão sejam varridas simultaneamente nos mesmos comprimentos de onda. Isso é o que se chama de espalhamento de luz em ângulo reto, ou RALS, e resulta no que é, na verdade, um espectro de refletância em ângulo reto. Esse tipo de varredura síncrona mede a luz refletida ou espalhada da excitação.