Apresentação do instrumento

Nossos sistemas são baseados em SPR acoplado por prisma na configuração de Kretschmann.

Um feixe colimado é enviado em direção à superfície de ouro funcionalizada através do prisma, a fim de iluminar toda a matriz com pontos de luz. Não há necessidade de realizar uma varredura 2D da matriz.

Após a reflexão no chip, o feixe é interceptado pelo sensor de imagem da câmera (matriz 2D), onde cada pixel corresponde a uma determinada localização no SPRi-Biochip.

A configuração óptica proprietária da HORIBA permite um sistema de imagem simples, porém muito preciso, sem nenhum componente móvel além de um espelho de varredura.

A rotação deste espelho permite selecionar o ângulo de trabalho em relação ao ângulo de ressonância para medições cinéticas. Os ângulos de trabalho (posições nas quais as curvas cinéticas serão registradas) são escolhidos no ponto de maior inclinação da curva de refletividade.

As medições cinéticas consistem no monitoramento simultâneo das variações de refletividade ao longo do tempo, em até várias centenas de pontos.

Com os sistemas SPR clássicos, é possível monitorar apenas algumas interações em paralelo. Os sistemas de imagem permitem o monitoramento de até várias centenas de interações em paralelo graças a uma célula de fluxo especial.

O número de canais corresponde ao número de diferentes ligantes que podem ser imobilizados. Os ligantes são imobilizados no sistema, utilizando o sistema microfluídico. A microfluídica requer um volume de amostra menor, mas apresenta limitações para algumas aplicações (soro, plasma, células, etc.). Nossa configuração microfluídica permite o estudo de amostras brutas sem o risco de entupimento da célula de fluxo ou dos componentes microfluídicos.

Além disso, o acoplamento com outras técnicas, como a espectrometria de massa, é mais complexo com sistemas de canais. De fato, a amostra precisa ser recuperada e reconcentrada diversas vezes, aumentando as etapas experimentais e aumentando o risco de contaminação e/ou perda da amostra. Os instrumentos HORIBA tornam a SPRi-MS rápida e descomplicada. Isso porque o design de um biochip dedicado permite a identificação de analitos diretamente no biochip, sem a necessidade de uma etapa de recuperação.

Comparação entre formatos multiplex e de canal:

Um dia de trabalho com nossos instrumentos SPRi equivale a 3 meses de trabalho com um instrumento de canal convencional.

Informações de alto rendimento são obtidas em uma única execução. Por exemplo, com um único SPRi-Biochip, é possível otimizar as condições experimentais para a interação (concentração de imobilização, pH de imobilização, tampão de imobilização, etc.) e/ou triar diferentes ligantes simultaneamente. A multiplexação permite economizar tempo e reduzir custos com consumíveis.

A imagem permite monitorar simultaneamente as condições de ressonância em toda a superfície do biochip graças à câmera. É possível visualizar todos os pontos do biochip (imagem da célula de fluxo) e os pontos onde ocorrem as interações após a injeção do analito (imagem de diferença).

Em nossa configuração, os ligantes devem ser imobilizados fora do instrumento SPRi com um aplicador automático ou manual, pois trabalhamos em formato de matriz e a configuração fluídica não permite a deposição de pontos na superfície do biochip dentro do instrumento SPRi. Já com o aparato SPR clássico, os ligantes são injetados no sistema SPR e imobilizados diretamente nos canais. Essa deposição em formato de microarranjo permite uma imobilização de ligantes com maior rendimento.

A utilização da macrofluídica permite analisar soluções complexas e amostras brutas. Isso abre caminho para a exploração de novas aplicações e para a análise de amostras como hibridomas, soro ^7,8, saliva ⁹, leite ¹⁰ …

Em vez de injetar diferentes concentrações de analito (análise “clássica”), imobilizamos diferentes concentrações de ligante na superfície do biochip e injetamos o analito em uma única concentração (análise de “injeção única”). Um software específico permite então determinar as constantes cinéticas e calcular a afinidade da interação.

Não, porque os ligantes geralmente são fixados covalentemente ao SPRi-Biochip e não podem ser removidos. No entanto, é possível injetar muitas amostras diferentes sobre a mesma superfície do SPRi-Biochip, graças à solução de regeneração.

Esta etapa consiste em romper a ligação específica entre o ligante e o analito. As seguintes soluções podem ser utilizadas, dependendo das biomoléculas estudadas:

• Quelantes de cátions: EDTA
• Alta força iônica: NaCl 1 M, MgCl₂ ₂ M
• pH baixo: Glicina-HCl 100 mM pH 2, HCl 10-100 mM
• pH elevado: Glicina-NaOH 100 mM pH 9,5, NaOH 10-200 mM

Nossas superfícies SAM e 3D são projetadas para tolerar essas soluções de regeneração e, com os ligantes devidamente ancorados à superfície do sensor, várias etapas sucessivas de interação-regeneração tornam-se possíveis. O número de regenerações depende da afinidade entre o ligante e o analito, bem como da robustez dos ligantes.

Um experimento de SPR é realizado em uma solução tampão. A solução tampão circula continuamente dentro do instrumento. De acordo com o estudo de interação ligante/analito, espera-se que a composição do tampão de corrida melhore a ligação específica. Tampões salinos, como PBS, HEPES ou citrato, são recomendados. A composição, a concentração e o pH do tampão devem ser ajustados de acordo com as biomoléculas estudadas.

É possível detectar moléculas pequenas com massa molecular de até cerca de 200 Da (detecção direta). No entanto, o sucesso na detecção de uma molécula pequena depende do modelo de interação e das condições experimentais.

Detecção de pequenas moléculas (curvas cinéticas e determinação de afinidade). Os experimentos foram realizados com um biochip CMD e o SPRi-CFM.

^{Figuras 12-13: Detecção de pequenas moléculas (curvas cinéticas e determinação de afinidade). Os experimentos foram realizados com um biochip CMD e o SPRi-CFM.}

A solução da amostra é injetada utilizando um sistema de fluidos clássico (sem microfluídica); dessa forma, é possível injetar soluções de amostra altamente concentradas, como soro, lisados celulares e plasma.

Também é possível imobilizar proteínas de uma amostra bruta na superfície do biochip com boa especificidade graças a um anticorpo de captura e a uma etapa de reticulação eficiente, a fim de evitar o desprendimento da proteína da superfície do biochip durante a etapa de regeneração. Denominamos esse processo de imobilização por deposição em múltiplas etapas.

O acoplamento entre SPRi e MALDI-MS (Ionização por dessorção a laser assistida por matriz - Tempo de voo (MALDI-ToF)) é muito simples. É possível realizar as duas análises na mesma lâmina de SPRi.

Após a interação SPRi usando nossos sistemas (usando condições compatíveis com MS, ou seja, tampão, química, etc.), a lâmina SPRi é removida do sistema SPRi. A deposição da matriz e a digestão enzimática ocorrem em cada ponto individual. Em seguida, a lâmina SPRi é colocada no suporte da placa MALDI e a análise de massa é realizada diretamente na superfície do chip. Não é necessário um longo procedimento de eluição que possa causar perda de material ou contaminação da amostra ^16,17,18,19.

A espectrometria de massa MALDI é adequada para glicanos, análise de massa de peptídeos, proteínas pequenas ou digeridas, polímeros, DNA ou quaisquer compostos orgânicos.

Podemos caracterizar com sucesso proteínas e peptídeos derivados de proteínas digeridas in situ.

Cada etapa do experimento SPRi-MS é realizada na mesma superfície da lâmina SPRi. De fato, a superfície da lâmina SPRi é utilizada para imobilização do ligante, captura específica do analito, digestão in situ (se necessário) e análise MALDI-MS.