Qu'est-ce que la fluorescence ratiométrique ?

La fluorescence ratiométrique est une méthode qui mesure les intensités à deux longueurs d'onde ou plus d'un spectre d'excitation ou d'émission afin de détecter les modifications de l'environnement local. On utilise généralement une sonde spécifiquement sensible à un paramètre environnemental tel que la concentration ionique, le pH, la viscosité ou la polarité.

L'application de colorants ratiométriques pour trouver des propriétés sensibles à la sonde telles que la concentration en ions peut être utilisée en mesurant les spectres ou la cinétique.

Dans le spectre de Fura-2, on observe que l'excitation de fluorescence présente deux pics qui reflètent directement la liaison du calcium ionique libre en solution. À des concentrations élevées de calcium ionique libre, le pic d'excitation à 340 nm est relativement élevé. Lorsque la concentration de calcium ionique libre est faible, le pic d'excitation à 380 nm augmente par rapport au pic à 340 nm.

Le rapport des intensités à deux longueurs d'onde d'excitation de ces pics est directement corrélé à la concentration intracellulaire de calcium ionique libre. La mesure du rapport de fluorescence à 510 nm lors d'une excitation à 340 nm et 380 nm au cours du temps permet d'obtenir un graphique temporel de l'évolution de la concentration en cations calcium d'une solution. L'absorption cellulaire de calcium ionique libre est mesurée de cette manière.

Il existe d'autres sondes dont les spectres de fluorescence varient de la même manière en fonction des propriétés physiques telles que la polarité du solvant, le pH et les concentrations d'autres ions tels que le sodium, le potassium et le magnésium.

Voici un graphique du ratio, indiquant la réponse calcique intracellulaire d'une cellule auriculaire chargée en Fura-2. En prenant le ratio entre les deux intensités au cours du temps, la concentration en ions calcium peut être directement corrélée à cette courbe cinétique.