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How to calculate signal to noise ratio
Determining Signal to Noise Ratio of a Spectrofluorometer: Methods and formulas to ensure
accurate sensitivity comparisons
La fluorescence est une technique d'analyse très sensible. L'un des principaux critères à prendre en compte lors du choix d'un spectrofluoromètre est donc sa sensibilité. La sensibilité globale d'un spectrofluoromètre dépend de nombreux facteurs, notamment la conception optique, l'optique de couplage, l'intensité de la lumière d'excitation délivrée, l'efficacité de la collecte de fluorescence, la conception du spectromètre, la technologie du détecteur, etc. Par exemple, un système équipé d'une lampe de puissance supérieure ne garantit pas une meilleure sensibilité globale à la fluorescence.
Étant donné qu’il existe de nombreuses variables qui entrent en jeu dans la fabrication d’un fluoromètre sensible, il est nécessaire de disposer d’un test de référence standard qui peut être effectué par n’importe quel utilisateur, pour comparer correctement un fluoromètre à un autre.
Par le passé, certains fabricants de fluorimètres commerciaux utilisaient des limites de détection pour des molécules fluorescentes spécifiques, telles que le sulfate de quinine ou la fluorescéine, afin de démontrer la sensibilité. Cependant, aujourd'hui, les fluorimètres les plus sensibles sont capables de détecter des concentrations de fluorophores si faibles que la capacité à effectuer avec précision une dilution en série jusqu'à ces limites de détection devient discutable. De ce fait, le test Raman dans l'eau est devenu une norme industrielle et constitue une mesure fiable de la sensibilité relative entre différents instruments. Ce test est également préférable car l'eau ultrapure est facilement disponible partout dans le monde, l'échantillon est stable, le signal est relativement faible et la bande Raman de l'eau peut être mesurée sur toute la plage de longueurs d'onde de l'instrument, ce qui permet des comparaisons plus fiables qu'avec une seule sonde fluorescente. Cette spécification de sensibilité est dérivée du spectre d'émission de la bande vibrationnelle Raman de l'eau pure. Il est généralement acquis avec une longueur d'onde d'excitation sélectionnée à 350 nm, avec un balayage d'émission de 365 à 450 nm. En général, la sensibilité du fluoromètre est exprimée dans un rapport signal sur bruit (SNR) qui est une comparaison d'une valeur de signal en présence d'un signal, avec une valeur de bruit du système, en l'absence de signal.
Malheureusement, tous les fabricants n'utilisent pas les mêmes conditions expérimentales pour acquérir ces données, et n'utilisent pas non plus les mêmes formules pour calculer le rapport signal sur bruit (SNR) des données acquises. Il n'existe pas de bonne ou de mauvaise méthode de collecte ou d'analyse des données, mais il est clair que des méthodes et des analyses différentes peuvent donner des résultats très différents. Il est donc important de savoir non seulement comment le spectre Raman de l'eau a été acquis, mais aussi comment les données ont été traitées. Si vous pouvez vous assurer que les données sont acquises et analysées de manière uniforme, vous pouvez être sûr de réaliser une comparaison équitable entre deux fluorimètres différents.
Dans cette note technique, nous soulignons les différents facteurs influençant le rapport signal sur bruit et articulons la méthode HORIBA, pour permettre aux chercheurs de disposer des outils nécessaires pour effectuer une comparaison appropriée.
Depuis des décennies, HORIBA définit le rapport signal/bruit (RSB) comme la différence entre le signal de crête et le signal de fond, divisée par la racine carrée de ce dernier. Cette méthode est appelée « méthode FSD » (premier écart type).
On l'appelle également méthode de la racine carrée (SQRT).
La formule du rapport signal sur bruit FSD est présentée ci-dessous.
Le signal de crête est mesuré à l'intensité du pic Raman de l'eau à 397 nm (pour une excitation à 350 nm) et le bruit dans une région où aucun signal Raman n'est présent (450 nm). Un système optique parfait ne produirait aucun signal à 450 nm, car il n'y a pas d'émission Raman à cet endroit. Cependant, tous les systèmes électro-optiques présentent des niveaux de lumière parasite et de bruit, qui contribuent à un signal à 450 nm. La formule ci-dessus suppose que le bruit est régi par la statistique de Poisson et peut donc être calculé comme la racine carrée du nombre de signaux de base à 450 nm. Elle ne s'applique qu'à la détection par comptage de photons ; à des fins de comparaison, elle ne doit donc être utilisée que pour comparer deux spectrofluoromètres à comptage de photons.
Une autre méthode couramment utilisée consiste à diviser la différence entre le signal de crête et le signal de fond par la valeur efficace (RMS) du bruit sur le signal de fond. Cette deuxième méthode est utilisée par de nombreux fabricants et constitue la meilleure approche pour les spectrofluoromètres utilisant des détecteurs analogiques, dont les unités d'intensité varient d'un fabricant à l'autre.
La formule du rapport signal sur bruit RMS est présentée ci-dessous.
Pour mesurer correctement la valeur de bruit RMS pour le dénominateur, une deuxième expérience est réalisée où le fluoromètre excite à 350 nm et la cinétique est mesurée en fonction du temps à l'émission à 450 nm.
La formule RMS est donnée par,
où le signal de fond basé sur le temps est mesuré n fois et S est la valeur d'intensité moyenne sur l'analyse cinétique.
Toutes les entreprises n'utilisent pas la formule RMS ci-dessus. Certaines utilisent le bruit crête à crête des données hors crête, par exemple entre 420 et 450 nm, tandis que d'autres utilisent une estimation RMS, soit à partir de la partie hors crête du spectre, soit à partir d'une analyse cinétique secondaire du pic. En fin de compte, la méthode de détermination du bruit RMS n'est pas aussi cruciale que l'application de la même formule à toutes les comparaisons possibles.
En conclusion, il n'existe pas de méthode optimale pour calculer le rapport signal sur bruit pour la bande Raman de l'eau, et les méthodes utilisées varient selon les fabricants. La méthode FSD n'est valable que pour comparer les spectrofluoromètres à comptage de photons. Pour comparer un ou plusieurs systèmes utilisant une détection analogique, il est conseillé d'utiliser la valeur quadratique moyenne (RMS) ou une méthode d'estimation de la valeur quadratique moyenne (RMS).
Tant que les différents ensembles de données calculent la sensibilité de la même manière, toute méthode particulière fournira une mesure relative du SNR d'un spectre par rapport à un autre.
Tout comme la formule utilisée pour calculer le rapport signal sur bruit peut avoir un effet considérable sur la sensibilité apparente d’un ensemble de données spectrales particulier, la configuration matérielle de l’instrument et les paramètres expérimentaux de l’acquisition de données ont également un effet considérable sur la qualité du spectre acquis.
De nombreux paramètres, réglages et options matériels influent sur la sensibilité mesurée d'un spectrofluorimètre. Il peut donc être extrêmement difficile de comparer précisément la sensibilité relative de deux instruments différents, s'ils ne sont pas utilisés de manière quasiment identique. Nous abordons ci-dessous chacun de ces facteurs et leur impact sur les données obtenues.
Longueur d'onde d'excitation : La longueur d'onde d'excitation doit être identique pour tous les systèmes comparés. La méthode HORIBA utilise une excitation à 350 nm pour la bande Raman de l'eau, comme le font la plupart des autres fabricants. Avec une excitation à 350 nm, la bande d'émission Raman de l'eau atteint un pic à 397 nm.
Heureusement, la plupart des fabricants ont standardisé cette longueur d'onde d'excitation, car elle permet une meilleure comparaison. Cependant, il est parfaitement possible de modifier la longueur d'onde d'excitation pour tester la sensibilité dans une autre plage de longueurs d'onde (par exemple, le proche infrarouge).
Plage de balayage d'émission : La méthode HORIBA balaie le monochromateur d'émission de 365 à 450 nm, avec des incréments de 0,5 nm, de manière à collecter l'intégralité du pic Raman à 397 nm ainsi que le fond à 450 nm.
Bande passante (taille des fentes) : La méthode HORIBA utilise des fentes passe-bande de 5 nm sur les spectromètres d'excitation et d'émission. Certains fabricants spécifient des fentes de 10 nm, ce qui augmente la sensibilité par rapport à 5 nm. Il a été rapporté que doubler la taille des fentes à l'entrée et à la sortie d'un monochromateur peut quadrupler l'intensité d'excitation et le débit de détection d'émission, puisque le débit augmente au carré de la taille. Cependant, il s'agit d'une estimation simpliste qui doit être mesurée empiriquement. HORIBA a mesuré la différence de facteur avec le Fluoromax HORIBA et a observé que, pour ce dernier, doubler la taille des fentes de 5 à 10 nm multiplie par plus de trois le rapport signal/bruit global pour la bande Raman de l'eau. Cependant, ce résultat varie d'un fluoromètre à l'autre ; veillez donc à ne pas comparer avec des bandes passantes identiques.
Temps d'intégration (ou temps de réponse) : Il s'agit du temps pendant lequel le détecteur peut capter un signal à un pas de longueur d'onde donné. Il joue également un rôle important dans la sensibilité globale mesurée par un fluorimètre. La méthode HORIBA utilise un temps d'intégration d'une seconde à chaque point de longueur d'onde, comme d'autres fabricants. Cependant, certains fabricants spécifient un temps de réponse de 2 secondes, ce qui multiplie le rapport signal/ sur bruit global par près de deux. Veillez à utiliser le même temps d'intégration (de réponse) lors de la comparaison.
Type de PMT : La plupart des spectrofluoromètres utilisent un tube photomultiplicateur (PMT) comme seul détecteur d'émission de fluorescence, sans possibilité de changer de boîtier. C'est le cas de la plupart des fluorimètres analytiques de paillasse. Certains de ces systèmes permettent de sélectionner différents PMT individuels avec des plages de longueurs d'onde et des spécifications différentes. Les PMT qui ne détectent pas aussi loin dans le proche infrarouge que les autres PMT auront un nombre d'obscurité plus faible, offrant ainsi un meilleur rapport signal/bruit dans la plage de 350 à 400 nm. Cependant, ils peuvent ne pas être utilisables dans toute la plage de longueurs d'onde d'émission souhaitée pour un laboratoire particulier. Le PMT standard d'HORIBA utilisé dans les fluorimètres FluoroMax Plus, Fluorolog3 et QuantaMaster 8000 est le PMT Hamamatsu R928P, considéré comme la référence industrielle en fluorométrie. Dans ce cas, assurez-vous que chaque fluorimètre utilise le même PMT, si possible.
Filtres optiques : Un filtre optique peut être ajouté au trajet optique d’un fluorimètre, côté excitation ou côté émission de l’échantillon. Ces filtres peuvent être placés manuellement dans un porte-filtre à l’intérieur du compartiment à échantillon, ou intégrés à une roue à filtres qui place automatiquement différents filtres sur le trajet optique selon les protocoles expérimentaux sélectionnés. Les filtres optiques améliorent la réjection de la lumière parasite à des longueurs d’onde données et peuvent améliorer considérablement le rapport signal/bruit d’un fluorimètre. HORIBA n’utilise aucun filtre optique, hormis les spectromètres à balayage eux-mêmes, pour spécifier le rapport signal sur bruit (SNR) pour le Raman de l’eau avec les spécifications des séries Fluoromax, Fluorolog3 ou QuantaMaster 8000. Lors de la comparaison d’un fluorimètre HORIBA avec un fluorimètre utilisant des filtres automatisés, veuillez ne pas utiliser de filtre ; si le fluorimètre est automatique, veuillez vérifier la marque et le type de filtres utilisés, ainsi que leur emplacement, afin de reproduire une méthode expérimentale similaire avec un fluorimètre HORIBA.
Type de détecteur : Les fluorimètres de recherche modulaires sont généralement équipés d'un boîtier PMT standard, mais permettent d'utiliser différents types de détecteurs monocanaux afin d'étendre la plage de longueurs d'onde ou la durée de vie de fluorescence d'un instrument. Parmi les autres détecteurs, on trouve les boîtiers PMT refroidis, divers détecteurs à semi-conducteurs tels que l'InGaAs, les PMT, MCP, etc. Ces différents types de détecteurs ont un impact considérable sur le rapport signal/bruit de la mesure d'un échantillon donné. Par conséquent, lorsque vous comparez la sensibilité d'un fluorimètre à celle d'un autre, assurez-vous d'utiliser le même type de détecteur pour collecter les données des deux systèmes.
Température du détecteur : La plupart des spectrofluoromètres commerciaux utilisent des boîtiers PMT non refroidis, et de nombreux instruments ne proposent même pas d'option de détecteur refroidi. Un boîtier PMT refroidi peut améliorer la sensibilité d'un instrument en réduisant le bruit de fond (obscurité) par rapport au même PMT dans un boîtier ambiant. Les boîtiers PMT standard HORIBA des séries FluoroMaxPlus, Fluorolog3 et QuantaMaster 8000 sont des boîtiers PMT ambiants. Cependant, les séries Fluorolog3 et QuantaMaster 8000 proposent des boîtiers PMT refroidis en option pour améliorer la sensibilité et la détection NIR. Lorsque vous comparez des fluoromètres de recherche modulaires, veillez à comparer les données recueillies avec le même type de boîtier PMT (ambiant ou refroidi) et, si refroidi, à la même température.
Monochromateur simple ou double : Les fluorimètres de recherche modulaires permettent au chercheur de choisir entre un monochromateur simple ou double, que ce soit sur le chemin optique d'excitation ou d'émission. Le terme « double monochromateur » désigne ici deux étages de réseaux dispersifs, l'un après l'autre, avec une fente d'entrée, une fente intermédiaire et une fente de sortie. Un double monochromateur peut être configuré en mode additif ou dispersif, mais dans les deux cas, le débit et les caractéristiques de lumière parasite d'un monochromateur simple ou double sont très différents et auront un impact important sur le rapport signal/bruit (RSB) d'un balayage Raman de l'eau, même à largeurs de bande, temps d'intégration et longueurs d'onde constants.
Densité des rainures du réseau : La densité des rainures d'un réseau affecte également le débit, et donc la sensibilité d'un spectrofluoromètre. Pour la plupart des spectrofluoromètres, ce problème n'est pas majeur, car les systèmes sont fabriqués avec un seul réseau. Dans ce cas, l'essentiel est de sélectionner des bandes passantes identiques. Cependant, pour les fluorimètres modulaires, vous pouvez configurer les monochromateurs avec différents réseaux, voire plusieurs. Pour ces systèmes, il est essentiel de veiller à ce que les résultats soient aussi similaires que possible. Par exemple, si vous avez deux instruments équipés de spectromètres de focale similaire, modifier la densité des rainures du réseau augmentera ou diminuera la sensibilité pour une même bande passante de 5 nm. La méthode HORIBA utilise des réseaux avec une densité de rainures de 1 200 rainures par millimètre.
Angle de Blaze du réseau : Les réseaux sélectionnés pour un monochromateur d'excitation ou d'émission offrent un débit optimal dans une bande de longueurs d'onde donnée, appelée angle de Blaze, car celui-ci est déterminé par l'angle de gravure du réseau appliqué à sa surface. Ainsi, un monochromateur d'excitation avec un monochromateur d'excitation blazé à 350 nm et un monochromateur d'émission à 400 nm seraient des choix optimaux pour obtenir la meilleure sensibilité Raman à l'eau lors d'une excitation à 350 nm. La plupart des fluorimètres ne permettant pas de régler le réseau, cette variable n'est pas un facteur. Cependant, pour ceux qui permettent de choisir des réseaux, veillez à choisir des réseaux avec un angle de Blaze identique ou très similaire pour une comparaison valable.
Les conditions expérimentales pour l’analyse par émission Raman de l’eau ultrapure étaient les suivantes.
Spectrofluoromètre QuantaMaster QM-8075-11 (lampe au xénon de 75 watts, monochromateur à excitation unique et à émission unique) avec boîtier PMT refroidi en option.
Les résultats expérimentaux sont ci-dessous.
Notez que ce résultat particulier dépasse la spécification minimale HORIBA Raman FSD pour l'eau pour le spectrofluoromètre QM-8075-11 lorsqu'il est équipé d'un PMT R928 refroidi en option, qui est actuellement spécifié à > 30 000:1 (méthode FSD).
Résultats de l'analyse Raman FSD de l'eau
Bien qu'il faille veiller à ce que les conditions expérimentales et les formules mathématiques soient appliquées de manière cohérente, le rapport signal/bruit Raman de l'eau est un bon déterminant de la sensibilité relative d'un fluoromètre par rapport à un autre.
Lors de la comparaison des spectrofluoromètres à comptage de photons, la méthode FSD (SQRT) est préférée.
HORIBA possède une tradition d'excellence de plusieurs décennies dans la fabrication de fluorescence, et nous sommes heureux de démontrer exactement les conditions dans lesquelles nous atteignons nos spécifications de sensibilité de pointe dans l'industrie.
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