Qu'est-ce qu'une mesure de fluorescence ?

À température ambiante, la plupart des molécules occupent l'état d'énergie le plus bas, appelé état fondamental. Cet état fondamental comprend des niveaux vibrationnels. Avant d'être excitées, de nombreuses molécules occupent le niveau vibrationnel le plus bas.

Le photon absorbé amène la molécule à adopter un état vibratoire plus élevé lorsqu'elle absorbe une certaine longueur d'onde de lumière. Les molécules entrent alors en collision avec d'autres molécules, ce qui entraîne une perte d'énergie vibratoire et un retour au niveau vibratoire le plus bas de l'état excité. La molécule peut alors revenir aux niveaux vibratoires fondamentaux.

Lorsque la molécule revient à son état fondamental, elle émet un photon lumineux à une longueur d'onde différente de celle qui l'a excitée. C'est alors que la molécule présente une fluorescence. (Voir diagramme de Jablonski)

La fluorescence est mesurable à l'aide de fluorimètres. Un fluorimètre est un instrument conçu pour mesurer les différents paramètres de la fluorescence, notamment son intensité et la distribution des longueurs d'onde de l'émission après excitation. Les chimistes l'utilisent pour identifier les propriétés et la quantité de molécules spécifiques dans un échantillon.

Les chimistes appellent fluorophores les molécules qui peuvent présenter une fluorescence.

Les scientifiques utilisent des spectromètres de fluorescence pour exciter les molécules fluorophores et mesurer leur fluorescence émise. Le spectromètre introduit de la lumière ultraviolette ou visible à l'aide d'une source de photons, comme un laser, une lampe au xénon ou des LED. La lumière traverse un monochromateur qui sélectionne une longueur d'onde spécifique, souvent grâce à un réseau de diffraction. Un réseau de diffraction est une lame de verre ou de métal, rythmée par des lignes parallèles très serrées, produisant un spectre par diffraction et interférence de la lumière. La lumière qui en sort est émise selon un angle spécifique dépendant de sa longueur d'onde.

Le spectromètre focalise la longueur d'onde monochromatique vers l'échantillon. Ce dernier émet une longueur d'onde qui se propage jusqu'au détecteur. Ce dernier est généralement placé à un angle de 90 degrés par rapport à la source lumineuse afin d'éviter toute interférence avec la lumière d'excitation transmise.

Les photons émis frappent un photodétecteur. Un logiciel connecté au détecteur génère un spectre, une représentation graphique indiquant les longueurs d'onde absorbées par l'échantillon.

Le spectre d’émission montre quelles longueurs d’onde les échantillons émettent.