La fluorescence est un type de luminescence provoqué par l'excitation d'une molécule par des photons, l'élevant à un état d'excitation électronique. Elle est provoquée par l'absorption de photons dans l'état fondamental singulet, puis promus à un état d'excitation singulet. Lorsque la molécule excitée revient à son état fondamental, elle émet un photon d'énergie inférieure, correspondant à une longueur d'onde plus grande, à celle du photon absorbé.
La spectroscopie de fluorescence analyse la fluorescence d'une molécule en fonction de ses propriétés fluorescentes. La fluorescence est un type de luminescence provoquée par l'excitation d'une molécule par des photons, l'élevant ainsi à un état d'excitation électronique.
Diagramme de Jablonski de l'absorbance moléculaire et de la fluorescence
La figure ci-dessus présente le diagramme de Jablonski (Jablonski, 1933), un schéma de la transition d'état électronique d'une molécule lors du phénomène de fluorescence. L'axe de gauche représente l'augmentation de l'énergie, où une molécule fluorescente typique présente un spectre d'absorption. Ce spectre indique l'énergie ou les longueurs d'onde auxquelles la molécule absorbera la lumière.
Décroissance de la durée de vie de fluorescence de la fluorescéine (rouge), réponse de l'instrument (bleu) et ajustement (vert).
En termes simples, la durée de vie de fluorescence d'une molécule correspond au temps moyen passé dans l'état excité. Cela dépend du type de molécule et de son environnement local. Généralement, l'état excité décroît de manière exponentielle, comme l'indique l'équation ci-dessous. L'utilisation de la durée de vie de fluorescence présente des avantages par rapport à une mesure d'intensité, car il s'agit d'une mesure « absolue », contrairement à la mesure « relative » à l'état stationnaire (qui produit un signal moyenné dans le temps).
I(t) = I0exp (-t/τ)
τ est la durée de vie de la fluorescence ou le temps nécessaire à l'intensité pour décroître jusqu'à 1/e de sa valeur initiale.
Si plusieurs états excités sont présents, parfois parce que l'échantillon étudié contient un mélange de molécules fluorescentes et que les environnements locaux sont différents, ou qu'une molécule subit une transformation donnant naissance à différentes espèces d'états excités, la décroissance devrait être plus complexe. Il peut y avoir une décroissance exponentielle par état excité présent. Ceci peut être représenté par une somme d'exponentielles (voir ci-dessous), où α (le facteur pré-exponentiel) indique la concentration relative de chaque décroissance t par rapport à la décroissance globale observée.
Équations permettant d'obtenir les durées de vie de fluorescence, les constantes de temps des composants, les amplitudes et les moyennes
Afin de comparer les mesures, il est souvent utile de normaliser les facteurs pré-exponentiels. Si une comparaison de la concentration de chaque espèce fluorescente est nécessaire, on peut utiliser l'α normalisé. Si une comparaison de la contribution au spectre à l'état stationnaire (émission de fluorescence globale) est nécessaire, on peut utiliser l'amplitude fractionnaire ou relative (en %). Cette dernière est le facteur pré-exponentiel pondéré par la durée de vie.
Il peut parfois être tout aussi acceptable de représenter une désintégration complexe par une durée de vie moyenne. Cependant, il convient de noter que la meilleure façon d'y parvenir est de modéliser correctement la désintégration complexe, plutôt que de simplement tenter d'y ajuster une seule décroissance exponentielle. Dans la plupart des cas, l'utilisation de la durée de vie moyenne en amplitude est appropriée ; toutefois, pour les expériences d'extinction, il est plus judicieux d'utiliser la durée de vie moyenne en intensité de fluorescence. Des travaux publiés détaillent les mérites respectifs de ces moyennes (Lakowicz, 2006) (Berezin, 2010).
Les mesures de phosphorescence utilisent une source pulsée à durée de vie plus longue, telle qu'une lampe flash au xénon.
La phosphorescence est un processus où le photon est émis, non pas à partir d'un état excité singulet, mais à partir d'un état triplet interdit. L'échelle de temps d'émission est généralement de l'ordre de la picoseconde à la nanoseconde, tandis que la phosphorescence dure généralement quelques microsecondes, millisecondes, voire plus longtemps… minutes ou heures. Les chercheurs utilisent généralement une source pulsée, telle qu'une lampe flash ou une LED, pour mesurer les spectres et les désintégrations de phosphorescence sur ces échelles de temps plus longues. Les mesures de phosphorescence utilisent une source pulsée à durée de vie plus longue, telle qu'une lampe flash au xénon. La durée de la lampe flash permet de mesurer les spectres à différentes durées de vie de phosphorescence.
Les mesures de phosphorescence utilisent une source pulsée à durée de vie plus longue, telle qu'une lampe flash au xénon. La synchronisation de la lampe flash permet de mesurer les spectres à différentes durées de vie de phosphorescence.
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