Techniques de durée de vie de fluorescence : TCSPC, FRET, TRES et SSTD

TCSPC (Time-Correlated Single Photon Counting) est une méthode qui utilise la synchronisation d'une source d'excitation pulsée, comme un laser ou une LED, avec la synchronisation d'arrivée des photons sur un détecteur pour reconstituer la décroissance de la durée de vie sur plusieurs événements (répétition des impulsions et des photons détectés). Cette technique repose sur le fait que la probabilité de détecter un photon à l'instant t suivant une impulsion d'excitation est proportionnelle à l'intensité de fluorescence à cet instant.

La répétition d'un laser ou d'une LED pulsée à une fréquence de répétition relativement élevée (10 kHz à 100 MHz) est synchronisée avec l'arrivée du photon suivant sur un détecteur (PMT). Un système électronique de synchronisation, sous forme de convertisseur temps-numérique ou de convertisseur temps-amplitude (TAC), enregistre ces événements successivement, jusqu'à ce que des statistiques suffisantes soient collectées pour reconstituer la décroissance. Cette décroissance est ensuite ajustée à une fonction exponentielle afin de modéliser la décroissance de la durée de vie (t). Le TCSPC est généralement utilisé pour mesurer les durées de vie de fluorescence de la picoseconde à la microseconde.

Grâce au mode TCSPC cinétique, des mesures individuelles peuvent être réalisées en seulement 1 ms et jusqu'à 10 000 mesures peuvent être acquises en continu. Dès qu'une variation de la durée de vie de fluorescence se produit, cette approche, plutôt que l'intensité, peut être utilisée pour suivre un processus cinétique.

De toute évidence, un nombre suffisant de photons est nécessaire pour analyser les données. Un taux de répétition très élevé peut améliorer ce résultat, mais la durée de vie et l'intervalle de temps doivent être pris en compte afin de ne pas réexciter l'échantillon avant sa désintégration complète. Les données de durée de vie peuvent ensuite être utilisées pour construire des traces cinétiques du processus.

Si vous pouvez mesurer la fluorescence, vous pouvez mesurer le FRET (Transfert d'Énergie par Résonance de Förster). Le FRET est l'interprétation du résultat de mesure, plutôt qu'une technique de mesure. Le FRET se produit lorsque l'émission d'une molécule donneuse chevauche l'absorption d'une molécule acceptrice. Lorsque les deux molécules sont suffisamment proches, elles subissent une interaction dipôle-dipôle et un transfert d'énergie est effectué. La distance à laquelle 50 % de l'énergie est transférée est appelée distance de Förster ; cette valeur est généralement connue pour les paires FRET courantes. En mesurant la variation d'intensité de fluorescence ou la durée de vie de la molécule donneuse en présence de l'accepteur, on peut déterminer l'efficacité du FRET et donc la distance entre les deux molécules. Le FRET peut être mesuré à l'aide des spectres de fluorescence (intensités) ou des durées de vie de fluorescence.

Plusieurs mesures sont nécessaires ; ID, l'intensité (ou t_D, la durée de vie) mesurée au pic d'émission du donneur seul, I_DA, l'intensité (ou t_DA, la durée de vie) mesurée au pic d'émission du donneur en présence d'un accepteur, I_A, l'intensité (ou t_A, la durée de vie) mesurée au pic d'émission du donneur en présence d'un accepteur mais pas du donneur et I_B, l'intensité (ou t_B, la durée de vie) mesurée au pic d'émission du donneur en utilisant une solution à blanc (c'est-à-dire un tampon uniquement). À partir de celles-ci, l'efficacité, E, peut ensuite être utilisée avec la distance de Förster (R₀) pour calculer R, la distance entre les molécules donneuse et acceptrice mesurées. Voir les équations dans la figure ci-dessus.

L'extinction désigne la réduction de l'émission de fluorescence, c'est-à-dire une augmentation du taux de décroissance non radiative (knr). L'extinction peut être divisée en deux formes : « statique » et « dynamique ». Dans les deux cas, l'intensité de l'émission diminue, mais seule l'extinction dynamique entraîne une modification de la durée de vie de la fluorescence. Remarque : si la cinétique suit la cinétique de Stern-Volmer et qu'une durée de vie moyenne est utilisée, celle-ci doit être calculée à partir de la moyenne d'intensité.

L'effet du photoblanchiment augmente la durée de mesure, car il réduit efficacement le nombre de fluorophores émis (c'est-à-dire agit comme une diminution de concentration) et l'intensité de l'émission. La durée de vie reste inchangée.

La mesure spectrale d'émission résolue en temps est une technique qui mesure la décroissance de la fluorescence à différentes longueurs d'onde sur l'ensemble du spectre d'émission d'un échantillon. Un graphique 3D de l'intensité en fonction du temps et de la longueur d'onde est obtenu. En observant cet ensemble de données 3D dans la direction des spectres à différents instants plutôt que dans la direction des décroissances à différentes longueurs d'onde, le spectre d'émission résolu en temps peut être mesuré. Si un échantillon contient plusieurs émetteurs dont les spectres se chevauchent mais dont les durées de vie sont différentes, les spectres individuels de ces composants peuvent être séparés grâce à la méthode TRES.

Par exemple, le 2-naphtol s'ionise pour former du 2-naphtolate à l'état excité (Koti, 2001). Le spectre d'émission à l'état stationnaire présente deux pics, indiquant la présence des deux espèces. La mesure de la durée de vie à différentes longueurs d'onde sur l'ensemble du spectre d'émission révèle des taux de décroissance très différents à chaque pic d'émission. En ajustant les décroissances, on peut observer l'évolution des durées de vie et/ou des amplitudes des composants à différentes longueurs d'onde d'émission.

Pour le 2-naphtol, son pic d'émission à 354 nm présente une durée de vie différente de celle du 2-naphtolate, dont le pic d'émission se situe autour de 414 nm. Le modèle à deux états du 2-naphtol ionisé et non ionisé est clairement illustré par le TRES. Deux constantes de temps représentent les différents temps de désintégration du 2-naphtol (dominant 3,4 ns à 357 nm) et du 2-naphtolate (dominant 9,4 ns à 414 nm). Les données ci-dessous ont été mesurées sur un FluoroMax-4 équipé d'une électronique FluoroHub TCSPC et d'une source d'excitation NanoLED-280 fonctionnant à 1 MHz.

Une autre utilisation de la TRES est la mesure des constantes de temps de réorientation du solvant (Horng, 1995). En observant un seul fluorophore et l'évolution temporelle de son spectre d'émission, il est possible de tracer l'énergie du pic en fonction du temps et de l'ajuster pour obtenir une constante de temps. Dans ce cas, le décalage du spectre peut être dû à la réorientation des moments dipolaires des molécules de solvant en réponse à l'excitation du moment dipolaire du fluorophore. En ajustant l'énergie du pic du spectre d'émission en fonction du temps, on peut obtenir la ou les constantes de temps de réorientation des molécules de solvant (Horng, 1995).

Oui. Il existe plusieurs méthodes pour y parvenir, selon l'échantillon. Une mesure cinétique de la TCSPC peut être effectuée pour surveiller la liaison si la durée de vie change pendant le processus. L'anisotropie résolue en temps peut également être utilisée, car la liaison affecte le temps de corrélation rotationnelle. Ce temps étant dû à la variation de la taille effective de la molécule, il est proportionnel au volume effectif de la molécule.

Dans un exemple, un délai est utilisé après le flash de la lampe pour mesurer le spectre de phosphorescence. Sans délai, la fluorescence de courte durée du peptide dans cet échantillon ainsi que la phosphorescence de longue durée du terbium peuvent être observées.

En faisant varier le délai, on peut détecter sélectivement des espèces avec une phosphorescence de plus longue durée, distincte de la fluorescence de fond dans le même échantillon.

La composition des lanthanides dans les verres peut être étudiée grâce aux désintégrations de phosphorescence résolues en temps. Voici les données issues de l'étude de la teneur en erbium de différents verres par cette méthode. La durée de vie de l'erbium peut varier selon le type de verre et les procédés de fabrication.

La technique du boxcar, ou moyenne du boxcar, est une méthode permettant de mesurer une décroissance de la phosphorescence ou de la fluorescence de longue durée en intégrant des fenêtres d'intégration fixes sur toute la durée de décroissance du signal.

Une source pulsée, telle qu'une lampe flash au xénon, est mise en marche et un délai est défini après l'impulsion (idéalement, le moment où l'éclair est terminé). Le détecteur mesure une fenêtre d'intégration à plusieurs reprises afin d'obtenir une moyenne statistique de l'intensité à cette fenêtre après l'éclair. Ensuite, la fenêtre d'intégration est déplacée progressivement le long de la décroissance vers des temps de décroissance plus longs. De cette manière, une décroissance est produite et peut être ajustée à une décroissance exponentielle pour obtenir la durée de vie inverse de la vitesse de décroissance. La technique du « boxcar » peut être très lente, notamment avec des décroissances à longue durée de vie et des émetteurs faibles. Cependant, selon la largeur de l'impulsion au xénon, des durées de vie comprises entre 10 μs et quelques secondes peuvent être résolues à un coût relativement faible, grâce à une source lumineuse accordable.

SSTD est l'abréviation de « single shot transient digitizer ». La technique SSTD utilise une source de lumière pulsée, soit un laser pulsé, soit une lampe flash au xénon, pour acquérir la courbe complète de décroissance de la phosphorescence à partir de chaque flash de la source pulsée. Après chaque impulsion, la décroissance est capturée et numérisée en temps réel à l'aide d'un PMT et d'un numériseur de transitoires. Un moyennage rapide du signal est facilement obtenu, la décroissance complète étant mesurée après chaque tir. Les spectres résolus en temps peuvent être facilement mesurés par intégration numérique du signal de décroissance dans la plage temporelle définie par l'utilisateur et par balayage d'un monochromateur. Cela permet de discriminer les spectres en fonction de la durée de vie de l'état excité correspondant.

L'émission de fluorescence se produit à l'échelle de la picoseconde à la nanoseconde, tandis que la phosphorescence, mesurée par SSTD, se produit à l'échelle de la microseconde à la seconde. En faisant varier la position temporelle et la largeur de la porte de détection du signal, il est possible de détecter sélectivement les spectres de fluorescence et de phosphorescence, comme l'attestent les spectres de phénanthrène illustrés sur la figure ci-contre. Ici, l'émission de phénanthrène dans un verre congelé a été mesurée avec un retard de détection progressivement augmenté afin de diminuer la contribution de la fluorescence.

Un exemple d'application de la SSTD est illustré par la phosphorescence à température ambiante (RTP) du tryptophane Nase T1. Le signal a été extrait en éliminant la fluorescence excessive du tryptophane, ce qui aurait été extrêmement difficile à réaliser avec une source d'excitation continue. La décroissance de la phosphorescence de cette très faible émission a également été mesurée sur le même instrument grâce à la fonction Single Shot Transient Digitizer (SSTD) (HORIBA PTI QuantaMaster Series, 2017).

La technique du stroboscopique optique, également appelée technique du stroboscope, est une technique pulsée dans le domaine temporel qui consiste à faire clignoter une source lumineuse pulsée, puis à activer un PMT en envoyant une impulsion haute tension de très courte durée le long de la chaîne dynode du PMT. Ces flashs sont ensuite répétés et, grâce à un générateur de porte à retard, l'intensité est mesurée à un instant différent après le flash, afin de construire une courbe de décroissance. Cette méthode utilise ensuite plusieurs flashs et un moyennage pour améliorer le rapport signal/bruit de la décroissance.

La technique stroboscopique est une technique analogique intrinsèquement moins sensible que la TCSPC et ne bénéficie pas de véritables statistiques de Poisson comme cette dernière. Cependant, elle offre l'avantage de fournir des décroissances d'environ 150 ps à quelques secondes avec des sources à faible fréquence de répétition telles que des diodes laser, des LED, des OPO à commutation Q accordable ou des lasers à azote/colorant. La technique stroboscopique permet de mesurer directement des spectres résolus en temps ns en fixant la position de la porte à retard et en balayant le monochromateur d'émission.

L'un des avantages du Strobe est sa capacité à collecter les désintégrations sur des échelles de temps linéaires et non linéaires (progression arithmétique et logarithmique). Cette dernière facilite grandement la résolution des désintégrations multiexponentielles dont les durées de vie peuvent varier de plusieurs ordres de grandeur. Un autre avantage de la technique Strobe est sa compatibilité avec des lasers accordables à faible fréquence de répétition, tels que les lasers Q-switched/OPO ou azote/colorant, qui ne sont pas compatibles avec le TCSPC. Elle est également compatible avec les LED et les diodes laser fonctionnant jusqu'à environ 25 kHz.

Un exemple de durée de vie mesurée avec un stroboscope est l'analyse de la décroissance et de la distribution de la durée de vie des lames de ZnO, comme le montre la figure suivante.

La conversion ascendante de fluorescence est un processus à 2 photons, où un échantillon est excité par deux photons contemporains arrivant simultanément dans la région de longueur d'onde proche infrarouge et la fluorescence est émise à une énergie plus élevée (longueur d'onde plus faible) dans la région visible du spectre.

Bien que la puissance d'excitation nécessaire dépende de l'échantillon concerné, la conversion ascendante nécessite généralement une source d'excitation à flux photonique plus élevé, comme un laser. De ce fait, les sources TCSPC standard peuvent ne pas offrir le flux requis pour effectuer des mesures de conversion ascendante. Des lasers émettant à 980 nm peuvent être montés directement sur un compartiment échantillon pour exciter directement les échantillons et mesurer les spectres de conversion ascendante, les durées de vie, voire les rendements quantiques. Les lasers OPO à commutation Q avec une sortie NIR efficace peuvent également être utilisés pour mesurer la conversion ascendante de fluorescence.

Les molécules absorbant la lumière dans le proche infrarouge et pouvant être détectées, voire imagées, dans le visible sont utiles. En effet, les sources d'excitation UV à haute énergie ont tendance à photoblanchir ou à provoquer des photodommages dans les échantillons biologiques. Les sources proches infrarouges, quant à elles, sont excitantes à plus basse énergie et ne présentent généralement pas ce problème. Parmi les molécules présentant une conversion ascendante de fluorescence, on trouve les lanthanides, les nanoparticules semi-conductrices et les boîtes quantiques. Le même laser DPSS à 980 nm peut être pulsé par des impulsions TTL et utilisé pour les mesures de durée de vie de la conversion ascendante de fluorescence, soit avec la fonction MCS de la carte TCSPC, soit par la technique SSTD.

Bien que la fluorescence (et la phosphorescence) ait une large gamme d’applications, il existe deux grands domaines de recherche où l’utilisation de ce phénomène excelle :

• Sciences de la vie
• Science des matériaux

Dans toute application où la fluorescence est présente à l'état stationnaire, il peut être avantageux d'utiliser des méthodes de durée de vie pour obtenir des informations. Certaines de ces applications et techniques de fluorescence utilisables dans leur étude sont illustrées ci-dessous.

Sciences de la vie

Sciences des matériaux