Qu'est-ce que la spectroscopie A-TEEM ?

La spectroscopie A-TEEM permet d'acquérir simultanément l'absorbance, la transmittance et la matrice d'excitation-émission de fluorescence (A-TEEM) d'un échantillon donné. HORIBA a été le pionnier de cette technique avec le système breveté Aqualog et Duetta, qui associe la spectroscopie A-TEEM à une détection CCD multicanal simultanée pour des résultats extrêmement rapides.

Les spectromètres A-TEEM peuvent être utilisés pour les EEM de fluorescence ou pour les mesures d'absorbance en analyse multicomposants. Leur véritable puissance réside dans la correction de l'effet de filtre interne des EEM collectés. Ils représentent ainsi fidèlement et précisément les molécules d'intérêt sur une plage de concentrations beaucoup plus large et exploitable (généralement jusqu'à environ 2 unités d'absorbance). Ces EEM permettent ainsi une empreinte bien plus précise qu'avec un EEM collecté à partir d'un fluorimètre à balayage traditionnel. La spectroscopie A-TEEM introduit désormais la technique de fluorescence sur le marché de l'analyse et il a été démontré qu'elle peut, dans certains cas, remplacer les instruments traditionnels comme la HPLC ou le spectromètre de masse, offrant ainsi un outil d'analyse plus simple, plus rapide et moins coûteux.

Pour accéder à la véritable puissance de la spectroscopie de fluorescence A-TEEM, il faut utiliser des méthodes logicielles multivariées telles que l'analyse en composantes principales (ACP), la méthode des moindres carrés classiques (CLS) et l'analyse factorielle parallèle (PARAFAC).

La plupart des composants du CDOM présentent de larges spectres d'excitation et d'émission de fluorescence se chevauchant dans les domaines UV et visible. De nombreuses mesures d'échantillons sont utilisées pour créer un modèle, puis la chimiométrie permet d'obtenir des scores pour chaque composant dans un échantillon individuel. La particularité d'un EEM de fluorescence est qu'il peut être utilisé comme empreinte moléculaire. Cette méthode de fluorescence 3D permet de suivre très facilement les variations du spectre d'émission, du spectre d'excitation, ou des deux, pour l'analyse de l'eau, ainsi que pour de nombreuses autres applications.

Une application courante des EEM, et plus particulièrement de la spectroscopie A-TEEM, est l'analyse de la qualité de l'eau, notamment pour l'étude de la matière organique dissoute chromophore, également appelée CDOM. La matière organique dissoute comprend les acides aminés, les acides humiques, les acides fulviques et d'autres exemples de matières décomposées dans les sources d'eau naturelles, ou les sous-produits de désinfection des procédés de traitement de l'eau. Les A-TEEM permettent d'identifier la présence de chacun de ces éléments à de très faibles concentrations, généralement de l'ordre du ppb.

La plupart des composants du CDOM présentent de larges spectres d'excitation et d'émission de fluorescence se chevauchant dans les domaines UV et visible. De nombreuses mesures d'échantillons sont utilisées pour créer un modèle, puis la chimiométrie permet d'obtenir les scores de chaque composant dans un échantillon individuel. La particularité d'un EEM de fluorescence, corrigé pour l'IFE, est qu'il peut être utilisé comme une empreinte moléculaire précise. Les variations du spectre d'émission, du spectre d'excitation, ou des deux, peuvent être suivies très facilement grâce à cette méthode de fluorescence 3D pour l'analyse de l'eau.

Les spectromètres de masse électroniques (MEM) sont également utilisés pour étudier les produits pétrochimiques, les médicaments, les protéines et les sciences alimentaires, notamment le vin, la bière et de nombreuses autres boissons. L'exemple ci-dessous illustre un échantillon de vin italien mesuré avant et après un traitement d'oxydation d'une semaine (exposition à l'air). Le MEM et les spectres d'absorption correspondants donnent une empreinte du vin, révélant des modifications de la forme et de l'intensité du spectre de fluorescence de composants tels que l'acide caféique, les flavanols, l'épicatéchine, l'acide gentisique et les anthocyanes.

En utilisant l'analyse chimiométrique, les EEM individuels sont également utilisés pour caractériser les nanotubes de carbone à paroi simple. (Note d'application HORIBA : Fluorescence Spectra from Carbon Nanotubes with the Nanolog, nd) Le nanotube de carbone, qui est une feuille de graphène laminée, peut être à paroi simple ou à parois multiples (plusieurs feuilles laminées). (Dresselhaus, 2000) (O'Connel, 2002) Seuls les nanotubes de carbone à paroi simple (SWCNT) émettent des photons en raison de leurs propriétés semi-conductrices.

L'angle de pliage hélicoïdal affecte également les longueurs d'onde d'absorption et d'émission des SWCNT (Bachilo, 2002). Selon que la feuille de graphène est enroulée horizontalement ou obliquement, la structure du carbone diffère. La géométrie spécifique peut être décrite par le vecteur d'enroulement contenant la longueur (la circonférence du tube) et un angle d'hélice a (de 0 à 30°). Les deux nombres (n, m) sont donc utilisés pour la définition des SWCNT. L'angle d'hélice exprimé en (n, m) est :

Dans le cas des SWCNT, le semi-conducteur absorbe entre les niveaux d'énergie c2 et v2, où le trou électronique est transmis vers le bas, comme illustré à la figure 34. Un photon est émis au niveau de la bande interdite, ou niveau d'énergie c1-v1. Ces bandes de conduction et d'émission dépendent du diamètre du nanotube de carbone, également appelé rayon de Bohr de l'exciton. Plus le rayon est petit, plus l'énergie de la lumière absorbée et émise est élevée (ou les longueurs d'onde sont courtes). Ceci est dû à l'effet de confinement quantique, qui impose que la longueur d'onde de la lumière émise soit limitée par la taille de la particule, ou dans ce cas, par le diamètre du tube. (O'Connel, 2002) (Dresselhaus, 2000)

Avec l’essor de la production de protéines à l’aide de cultures cellulaires de mammifères, il est devenu de plus en plus important de contrôler la qualité des milieux de culture cellulaire destinés à être utilisés dans les processus de production.

Les milieux de culture cellulaire sont généralement préparés sous forme de solutions aqueuses et doivent fournir tout ce dont une lignée cellulaire a besoin pour une croissance cellulaire optimale ainsi que pour le rendement et la qualité du produit.

Dans tout procédé de bioréacteur, il est important d'identifier le type et la qualité du milieu de culture cellulaire approprié, car même de subtiles variations de composition peuvent avoir un impact notable sur la vitesse de croissance et le rendement de la culture cellulaire. Par conséquent, la composition et la qualité des milieux de culture cellulaire en bioréacteur doivent être rigoureusement contrôlées afin de maintenir un procédé optimal. Par conséquent, les méthodes d'identification et d'analyse de la qualité des milieux de culture cellulaire sont devenues un enjeu majeur dans ce domaine.

Un balayage synchrone se produit lorsque le monochromateur d'excitation et le monochromateur d'émission effectuent un balayage simultané, ce qui permet de lire l'émission de fluorescence. Généralement, un décalage entre les monochromateurs d'excitation et d'émission peut être défini, correspondant au décalage de Stokes (différence entre les pics d'excitation et d'émission). Ces types de balayages synchrones ont toujours été utilisés pour l'analyse des composants, mais grâce aux instruments plus modernes de mesure des EEM avec détecteurs CCD, l'EEM fournit davantage d'informations et prend le même temps.

Un décalage de 0 nm peut être défini afin que l'excitation et l'émission balayent simultanément aux mêmes longueurs d'onde. C'est ce que l'on appelle la diffusion de la lumière à angle droit (RALS), qui produit en réalité un spectre de réflectance à angle droit. Ce type de balayage synchrone mesure la lumière réfléchie ou diffusée par l'excitation.