Une matrice d'émission d'excitation typique (EEM)
Une mesure de plus en plus utilisée en spectroscopie de fluorescence est la matrice d'excitation-émission (MEE). Une MEE est un balayage 3D qui produit un tracé de contour de la longueur d'onde d'excitation, de la longueur d'onde d'émission et de l'intensité de fluorescence. Les MEE sont utilisées pour diverses applications nécessitant une analyse multicomposante et sont souvent considérées comme fournissant une empreinte moléculaire pour de nombreux types d'échantillons.
Certaines des premières utilisations publiées de la spectroscopie EEM datent des années 1980, lorsque la technique a été utilisée pour étudier la fluorescence du tryptophane dans les lipoprotéines de faible densité du sérum sanguin humain (Koller, 1986) et pour étudier les composants fluorescents dans le plasma humain de patients atteints de tumeurs (Leiner, 1986).
Les fluorimètres à balayage traditionnels ne permettent pas d'exploiter pleinement la puissance de l'identification moléculaire par EEM en raison de trois limitations fondamentales. Premièrement, les spectrofluoromètres à balayage traditionnels ne peuvent pas compenser intrinsèquement les variations de concentration des molécules fluorescentes dans l'échantillon. L'effet de filtre interne (IFE) est un phénomène bien connu qui déforme le spectre de fluorescence mesuré d'une molécule en raison de l'absorption qui se produit à des concentrations d'échantillon plus élevées (généralement supérieures à 0,1 à 0,2 unité d'absorption). La seule façon de corriger l'IFE avec un fluorimètre traditionnel est d'acquérir une mesure secondaire sur un autre spectromètre d'absorption et d'ajuster le signal de fluorescence mesuré en conséquence. Cependant, cette opération est également très délicate, car les mesures ne sont pas effectuées simultanément et avec les mêmes volumes exacts. De ce fait, les fluorimètres à balayage traditionnels manquent d'indépendance de concentration, ce qui limite considérablement la capacité d'un EEM traditionnel à identifier avec précision de nombreux échantillons.
Deuxièmement, étant donné que les fluoromètres mesurent par définition la fluorescence, ils manquent d’informations importantes sur l’absorbance et la couleur pour toutes les molécules non fluorescentes qui peuvent être un élément essentiel d’une identification moléculaire multicomposant complète.
Un développement récent, l'acquisition simultanée de mesures d'absorption, de transmission et de fluorescence (A-TEEM), est disponible sur deux spectrofluoromètres HORIBA et résout bon nombre des problèmes décrits ci-dessus tout en corrigeant instantanément l'effet de filtre interne. Les mesures étant prises simultanément, les variations de concentration sont inexistantes.
Enfin, les instruments à balayage monocanal sont très lents, nécessitant plusieurs minutes, voire une heure, pour collecter un ensemble complet de données. Par conséquent, les fluorimètres à balayage sont limités à la quantité de données EEM qu'ils peuvent collecter en une journée et ne peuvent travailler qu'avec des échantillons stables pendant la durée d'acquisition.
La précision de la fluorescence EEM, sans correction IFE, est limitée aux échantillons dont les concentrations sont inférieures à environ 0,1-0,2. Pour exploiter pleinement la puissance des EEM de fluorescence, il est nécessaire d'utiliser des méthodes logicielles multivariées telles que l'analyse en composantes principales (ACP), la méthode des moindres carrés classiques (CLS) et l'analyse factorielle parallèle (PARAFAC).
L'effet de filtre intérieur
L'effet de filtre interne comprend deux processus : l'effet de filtre primaire (PIF) où l'intensité de la lumière d'excitation est progressivement diminuée en raison de l'absorption en fonction de la longueur du trajet optique de l'échantillon liquide avant d'atteindre le volume fluorescent et l'effet de filtre secondaire (SIF), où l'intensité de fluorescence émise est diminuée en raison de la réabsorption même par la partie de l'échantillon qui n'est pas excitée directement par le faisceau d'excitation.
Conséquence spectrale de l'effet de filtre interne
Les EEM sont de plus en plus utilisés pour l'analyse de la qualité de l'eau, notamment pour l'étude de la matière organique dissoute chromophore, également appelée CDOM. La matière organique dissoute comprend les acides aminés, les acides humiques, les acides fulviques et d'autres exemples de matières décomposées présentes dans les sources d'eau naturelles, ou de sous-produits de désinfection issus des procédés de traitement de l'eau.
Les EEM permettent d'identifier la présence de chacun de ces composés à de très faibles concentrations, généralement de l'ordre du ppb. Idéalement, les instruments utilisés pour cette application mesurent simultanément les spectres de fluorescence et d'absorption.
Étant donné que la fluorescence est linéaire avec une concentration uniquement à des valeurs d'absorption inférieures à environ 0,1-0,2, les échantillons d'absorption plus élevée doivent utiliser des corrections à l'intensité de fluorescence pour les effets de filtre interne par mesure et application du spectre d'absorption UV-visible.
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