À titre d’exemple d’expérience de fluorescence sur un point singulaire, voici une courbe d’étalonnage d’un ensemble connu de microsphères fluorescentes.
Étant donné que l’intensité de la fluorescence dépend de la concentration de la molécule fluorescente, des courbes de concentration standard peuvent être générées facilement et utilisées pour déterminer les concentrations de la même molécule dans des échantillons inconnus.
Ceci est utile dans les expériences d'extinction, où les additifs diminuent systématiquement l'intensité des fluorophores. Des courbes de concentration peuvent également être créées pour étudier l'interaction d'autres molécules avec des éléments tels que les protéines, et permettent de suivre systématiquement les modifications structurelles, le repliement, le dépliage, l'association et la dissociation des protéines.
À titre d'exemple d'expérience de fluorescence sur un point singulaire, voici une courbe d'étalonnage d'un ensemble connu de microsphères fluorescentes. Cinq solutions de concentration connues ont été utilisées pour créer la courbe étalon. La courbe a été ajustée à un polynôme linéaire et l'ajustement a permis de calculer la concentration de billes dans une solution inconnue.
Spectres de naphtalène dissous dans le méthanol mesurés à température ambiante (298 K) et dans un accessoire Dewar à azote liquide (77 K) sur un HORIBA Fluorolog-3.
La température a un effet sur l'intensité de la fluorescence, et parfois aussi sur la longueur d'onde et la forme spectrales. Le coefficient d'extinction molaire d'un émetteur de fluorescence (ou constante de vitesse radiative) dépend généralement peu de la température. En revanche, la constante de vitesse non radiative, régie par le couplage vibrationnel, est fortement affectée et augmente avec la température. Cela signifie que la fluorescence diminue généralement avec la température. De même, l'extinction collisionnelle augmente également avec la température, diminuant ainsi l'intensité de la fluorescence.
La fluorescence est fortement influencée par les molécules entourant la molécule émettrice. De plus, les fluorophores mesurés à très basse température avec de l'azote ou de l'hélium liquide présentent une fluorescence accrue et une structure vibrationnelle accrue dans les spectres d'excitation et d'émission. L'extinction collisionnelle diminue, tout comme la constante de vitesse non radiative, augmentant ainsi l'intensité de l'émission de fluorescence.
Les molécules telles que les hydrocarbures polyaromatiques (anthracène, naphtalène, pyrène, pérylène, etc.) présentent des pics vibrationnels qui apparaissent dans le spectre à température ambiante. À 77 K dans l'azote liquide, ces pics de fluorescence deviennent plus structurés et des pics de phosphorescence sont mesurables. Les pics ci-dessous ont été mesurés à 298 K et à 77 K dans un récipient d'échantillonnage Dewar à azote liquide.
Spectre d'émission soustrait du blanc (rouge) de microsphères rouges à 6,7 x 104 billes/mL (lexc = 542 nm).
Les pics Raman apparaissent souvent dans un spectre de fluorescence, surtout si l'intensité de fluorescence est faible. Pour supprimer un pic Raman, il suffit de mesurer le spectre d'un solvant blanc dans les mêmes conditions que celui de l'échantillon, puis de soustraire ce spectre blanc du spectre de l'échantillon fluorescent. Un pic Raman étant un phénomène vibrationnel lié à l'énergie de la lumière d'excitation, sa position peut être légèrement contrôlée. Un pic Raman se rapprochera ou s'éloignera de la longueur d'onde d'excitation selon que celle-ci est déplacée vers le bleu ou vers le rouge, respectivement. Ainsi, si un pic Raman interfère avec le spectre de fluorescence d'un échantillon, la longueur d'onde d'excitation peut être déplacée pour déplacer légèrement le pic Raman si nécessaire.
Modifications spectrales résultant du dépliage thermique de l'albumine sérique bovine (BSA) à l'aide d'un fluorimètre QuantaMaster
Les spectres de fluorescence peuvent également être utilisés pour suivre les changements de repliement ou de dépliement des protéines. Voici un exemple du spectre de fluorescence du tryptophane dans une solution de 1 μM de BSA avec une température croissante. Ces courbes représentent la température passant de 5 à 70 °C. On observe une diminution de l'intensité et un glissement du spectre vers des longueurs d'onde plus courtes à mesure que la température augmente. L'anisotropie, ou l'anisotropie résolue en temps, peut également être utilisée pour obtenir des informations sur la taille, la forme et le mouvement d'orientation de la protéine.
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