• A arquitetura TCSPC por pixel oferece 24.576 decaimentos simultâneos.
• tempos de vida complexos multicomponentes
• A cinética de decaimento é adquirida diretamente.
• Análise de amostras com até 5 decaimentos exponenciais
• Interface de software EzTime Image simples e eficiente
• Ideal para análises moleculares complexas e sofisticadas, como a dinâmica de células vivas e a detecção de biomarcadores para o diagnóstico de doenças.

Os avanços na tecnologia CMOS levaram ao desenvolvimento de sensores de imagem baseados em matrizes de pixels, onde cada pixel contém um fotodiodo de avalanche de fóton único (SPAD) e sua eletrônica de temporização associada, baseada em um conversor de tempo para digital (TDC).

Isso permite a determinação rápida (em velocidade de vídeo) do tempo de vida da fluorescência com base na técnica de contagem de fótons únicos correlacionados no tempo (TCSPC), realizada independentemente em cada pixel (Figura 1).

Figura 1: O acoplamento SPAD e TDC

Um sensor de imagem de 192 x 128 pixels, implementado em tecnologia CMOS de 40 nm, está incorporado em um sistema de microscopia de epifluorescência de campo amplo. O sensor possui um fator de preenchimento de 13% e cada pixel de 18,4 x 9,2 μm contém um TDC com resolução <40 ps. Isso permite até 24.576 medições simultâneas de tempo de vida de fluorescência, cada uma com 4.096 intervalos de tempo. Através de um firmware dedicado e da implementação do software HORIBA EzTime Image, a intensidade de fluorescência e o tempo de vida médio, bem como o gráfico de fasores gerado a partir da medição de imagem TCSPC, podem ser exibidos simultaneamente em tempo real em taxas de vídeo (>30 fps) (Figura 2).

Figura 2: Apresentação de quatro conjuntos de dados simultâneos

Modos de operação

O FLIMera foi projetado para uso com o software EzTime Image da HORIBA, altamente intuitivo. Este software é utilizado para controle, aquisição e análise de dados FLIMera. FLIMera oferece 4 modos de operação.

• Manual– Início e parada da aquisição pelo usuário, fornecendo imagem de intensidade TCSPC e dados FLIM para análise de tempo de vida.
• Temporizado– Tempo de execução definido pelo usuário para aquisição, fornecendo imagem de intensidade TCSPC e dados FLIM para análise de tempo de vida.
• Transmissão para arquivo HDF5– Os dados do TCSPC podem ser transmitidos, por um período de tempo determinado pelo usuário, para um arquivo HDF5. Este arquivo contém registros completos para cada fóton em cada pixel, de modo que nenhum dado é perdido, e pode ser usado para reconstruir quadros para análise completa do decaimento.
• Gráfico de fasores– Complementando a representação do histograma, há a capacidade de exibir e selecionar dados de tempo de vida na forma de um gráfico de fasores em tempo real, como mostrado na Figura 3. O gráfico de fasores requer calibração inicial usando um padrão de tempo de vida.

Figura 3: Diagrama fasorial

A capacidade de reprodução em vídeo é demonstrada usando amostras padrão e células de levedura marcadas com FUN-1 (Figura 4).

Figure 4: Sequence of images extracted from FUN-1 labeled yeast cell lifetime video https://youtu.be/1Fu7VOCsHuA

Figura 5a: Decaimento do sistema de cubetas DeltaFLEX

Figura 5b: O decaimento de apenas um dos 24.578 pixels SPAD demonstra a altíssima resolução e fidelidade TCSPC do FLIMera

FLIM e HORIBA

A inovação da tecnologia de detecção e temporização em nível de pixel possibilita uma abordagem de imagem de campo amplo, que reduz significativamente os tempos de aquisição de dados, permitindo o estudo de eventos dinâmicos. FLIMera contribui para a longa trajetória da HORIBA no campo da medição de fluorescência, reconhecida com a conquista do prestigioso Prêmio de Inovação Empresarial do Instituto de Física.