A-TEEM ™ combina medições simultâneas de absorbância, transmitância e matriz de excitação-emissão de fluorescência em uma análise molecular 3D rápida e não destrutiva.
O novo analisador Veloci Biopharma da HORIBA traz essa inovação para o controle de qualidade farmacêutica, oferecendo:
Espectroscopia A-TEEM
Espectroscopia A-TEEM
Artigos de pesquisa, pôsteres e apresentações sobre A-TEEM
Nathan Fuenffinger – Merck & Co., Inc., Jennifer Pai Wang – Merck & Co., Inc., Louis Obando – Merck & Co., Inc.
A identificação pós-embalagem de todos os lotes fabricados é uma exigência geral da Food and Drug Administration (FDA) para produtos biológicos a serem distribuídos nos Estados Unidos. Como este é o último teste antes da liberação do lote pelo fabricante, é desejável uma técnica analítica rápida, simples e logisticamente eficiente. Idealmente, essa técnica permitiria a realização dos testes de identidade no mesmo local onde a embalagem é feita, evitando o tempo de espera significativo associado ao transporte do material para um laboratório de testes externo.
A espectroscopia de matriz de excitação-emissão simultânea de absorbância, transmissão e fluorescência (A-TEEM) é uma técnica com potencial para fornecer identificação rápida de produtos vacinais. Neste estudo, examinamos cerca de 1.100 espectros de 92 lotes de sete produtos vacinais de vírus vivo atenuado com formulações semelhantes, utilizando espectroscopia EEM. O conjunto de dados foi visualizado por meio da análise das imagens de fluorescência 3D resultantes e pela realização de análise exploratória com análise de componentes principais. Cada produto vacinal apresentou uma impressão digital espectral única, cuja especificidade foi derivada de diferentes intensidades do mesmo pico ou da ausência ou presença de picos adicionais. Por fim, modelos de classificação foram desenvolvidos utilizando a analogia de classe de modelagem independente suave (SIMCA) com o objetivo de identificar cada produto vacinal. Conjuntos externos de teste e validação, compostos por 84 frascos de 42 lotes não utilizados durante a calibração, foram usados para estabelecer a precisão dos modelos. No total, os modelos SIMCA alcançaram 100% de precisão na previsão da identidade das vacinas em aproximadamente 1.300 instâncias durante a calibração, teste e validação, comprovando assim a adequação dos modelos para o uso pretendido.
Nicole Ralbovsky, PhD – Merck
A Tecnologia Analítica de Processos (PAT, na sigla em inglês) tem sido cada vez mais explorada na indústria farmacêutica de grandes moléculas, com ênfase particular no setor de vacinas. A PAT visa proporcionar maior compreensão e controle do processo por meio do monitoramento em tempo real de atributos críticos de qualidade e parâmetros-chave do processo, bem como da detecção de desvios. A purificação a jusante em processos de fabricação de vacinas pode ser complexa e exigir uma caracterização analítica extensa. Neste trabalho, apresentamos o desenvolvimento de um método de PAT para uso como Controle em Processo durante a fabricação clínica de um princípio ativo de vacina. Além disso, ilustramos como a PAT também pode ser usada para a caracterização rápida de um produto farmacêutico vacinal. No primeiro caso, a espectroscopia UV-Vis SoloVPE é utilizada como um método rápido e preciso para a determinação da concentração total de proteínas; no segundo caso, a imagem hiperespectral Raman com aprendizado de máquina é empregada para a caracterização analítica e compreensão da formulação de um produto farmacêutico. Ambos os trabalhos ilustram as vantagens da PAT no desenvolvimento de processos de vacinas e na fabricação clínica, e indicam a utilidade da PAT para a otimização e o aprimoramento de processos.
Rita C. Barral – Sanofi, Tecnologia Analítica de Processos – Plataforma de Mamíferos, Framingham, Massachusetts, EUA; Marina Hincapie – Sanofi, Tecnologia Analítica de Processos – Plataforma de Mamíferos, Framingham, Massachusetts, EUA; John Bobiak – Sanofi, Manufatura, Ciência e Tecnologias – Plataforma de Mamíferos, Framingham, Massachusetts, EUA; Esra Kiran – Sanofi, Manufatura, Ciência e Tecnologias – Plataforma de Mamíferos, Framingham, Massachusetts, EUA; Lia Tescione – Sanofi, Manufatura, Ciência e Tecnologias – Plataforma de Mamíferos, Framingham, Massachusetts, EUA
Na área de bioprocessamento, uma das que mais cresce é a Tecnologia Analítica de Processos (PAT, na sigla em inglês), que busca inovar no desenvolvimento e na fabricação de processos biológicos. O termo PAT abrange uma ampla gama de tecnologias analíticas avançadas, incluindo analisadores, sensores virtuais, sistemas automatizados de amostragem, plataformas de gerenciamento de dados e estruturas de automação. De modo geral, a PAT é uma abordagem rica em dados que leva a uma melhor compreensão dos processos, pois os resultados são obtidos em minutos ou até mesmo segundos, em vez de horas ou dias.
Os meios de cultura celular utilizados em processos upstream de mamíferos são soluções aquosas que contêm diversos componentes, o que explica sua complexidade. Esses componentes incluem, entre outros, aminoácidos, vitaminas e metais. A análise dessas misturas é complexa devido à sua natureza. Para triagem de rotina, técnicas rápidas baseadas em espectroscopia, especificamente a espectroscopia Raman, têm sido empregadas; no entanto, esse método apresenta limitações na diferenciação de diferentes tipos de meios de cultura celular quando as variações são da ordem de micromolar.
Neste estudo, investigamos um método alternativo com múltiplos atributos para analisar meios de cultura celular, que oferece maior sensibilidade. Nossa investigação focou no uso da Matriz de Absorbância-Transmissão-Excitação-Emissão (A-TEEM) em conjunto com métodos quimiométricos, como a Análise de Fatores Paralelos (PARAFAC) e a Regressão por Mínimos Quadrados Parciais Não Lineares (NPLS). Com o método desenvolvido, conseguimos observar alterações na composição de diferentes meios de cultura celular e avaliar a qualidade dos meios, diferenciando entre amostras vencidas e não vencidas.
De modo geral, este A-TEEM poderá tornar-se uma alternativa mais adequada aos métodos baseados na espectroscopia Raman, o que melhoraria significativamente a nossa compreensão da variabilidade nos meios de cultura celular.
Lyufei Chen, PhD –HORIBA Instruments, Jeffrey Julien –HORIBA Instruments
A variabilidade nos meios de cultura celular impacta significativamente o crescimento celular, a produtividade e o perfil de qualidade das proteínas terapêuticas expressas. Com a expansão da indústria biofarmacêutica, há uma crescente necessidade de monitorar a consistência dos meios de cultura celular, tanto entre lotes quanto ao longo do tempo. Nesta apresentação, demonstraremos um novo método de qualificação e quantificação aplicado a meios de cultura celular disponíveis comercialmente. Este método é baseado em A-TEEM, uma técnica espectroscópica multimodal que integra espectroscopia UV/Vis (AT para Absorbância-Transmissão) e fluorescência 3D (EEM para Matriz de Excitação-Emissão). Também apresentaremos o uso de PARAFAC (Análise de Fatores Paralelos), que decompõe as matrizes de excitação-emissão de fluorescência em seus componentes químicos subjacentes. Ao combinar A-TEEM com PARAFAC, podemos qualificar meios de cultura celular por meio do agrupamento e classificação de lotes, bem como quantificar os meios de cultura celular para fornecer informações sobre a concentração de componentes principais, como triptofano, tirosina, piridoxina, ácido fólico e riboflavina. Essa técnica fornecerá uma ferramenta alternativa sensível para a análise do perfil de meios de cultura celular, sendo fácil de usar e exigindo preparação mínima da amostra.
Alan G. Ryder, PhD (ele/dele/seu) – Laboratório de Biofotônica em Nanoescala, Universidade de Galway, Matheus A. de Castro – Laboratório de Biofotônica em Nanoescala, Universidade de Galway
A poli-N-isopropilacrilamida (PNIPAm), um polímero termossensível e altamente solúvel em água abaixo de sua Temperatura Crítica de Solução Inferior (LCST), é amplamente utilizada em aplicações biomédicas, como a liberação de fármacos. Entretanto, a PNIPAm é muito propensa à agregação, tanto no estado sólido quanto em solução, que pode ser induzida por fontes relativamente inócuas, como armazenamento prolongado em ambientes úmidos e tensões na interface ar-água. Portanto, a capacidade de medir de forma rápida, econômica e precisa o tamanho e o estado de agregação da PNIPAm em solução é crucial para aplicações que exigem proporções moleculares estequiométricas.
A dispersão dinâmica de luz (DLS) é provavelmente a técnica de dimensionamento de nanopartículas mais amplamente disponível e de baixo custo, mas apresenta limitações em relação à velocidade de medição, concentração e polidispersidade que precisam ser cuidadosamente consideradas. A espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), utilizando fluoróforos covalentes ou não covalentes como sondas, também pode ser empregada; no entanto, apresenta desvantagens em termos de complexidade de medição, manipulação da amostra e concentrações de amostra utilizáveis.
No entanto, descobrimos que o PNIPAm disponível comercialmente era intrinsecamente fluorescente, com dois tipos distintos de emissão, presumivelmente provenientes das moléculas iniciadoras utilizadas durante a síntese. Ao medir a emissão intrínseca do PNIPAm utilizando espectroscopia de Matriz de Excitação-Emissão Polarizada (pEEM), é possível obter uma medição mais detalhada e informativa das alterações de tamanho em solução. As medições de pEEM podem ser implementadas nos modos de polarização paralela ou perpendicular, que, quando acoplados aos sinais de espalhamento Rayleigh, fornecem informações úteis sobre as alterações no tamanho das partículas. As grandes vantagens da análise de polímeros por pEEM em um contexto industrial são a ausência de marcadores, a necessidade mínima de manipulação da amostra e a possibilidade de implementação utilizando fluorômetros de bancada convencionais. Neste trabalho, demonstramos que o tamanho das partículas de PNIPAm (dados de referência obtidos por meio de medições de DLS) apresentou correlação (R² > 0,9) com a banda de espalhamento Rayleigh das medições de polarização paralela e que a alteração nas propriedades de emissão durante a agregação fornece um método conveniente para monitorar a agregação de polímeros induzida por interfaces ar-água.
Brendon M. Lyons, Mestre em Química – Bristol Myers Squibb, Jeffrey Julien –HORIBA Instruments, Lyufei Chen, PhD –HORIBA Instruments
A espectroscopia de Absorbância-Transmissão, Matriz de Excitação-Emissão (A-TEEM) foi avaliada para uma nova aplicação na triagem de produtos biológicos falsificados. Alguns produtos biológicos falsificados são difíceis de serem triados com ferramentas analíticas rápidas e de baixo custo. Por exemplo, produtos biológicos autênticos da BMS que são falsificados por desvio de mercado (ou seja, contrabando) exigem métodos analíticos altamente específicos para verificar a autenticidade e garantir a segurança do paciente. No entanto, as técnicas tradicionais de mapeamento de peptídeos são muito lentas, caras e trabalhosas para a triagem de produtos suspeitos em um laboratório forense de alto rendimento. Um estudo de prova de conceito foi realizado em colaboração com o fornecedor de instrumentos analíticos, HORIBA, para avaliar a especificidade da A-TEEM para estruturas proteicas de imunoglobulina G (IgG) semelhantes. A-TEEM é uma técnica espectroscópica tridimensional que pode caracterizar a composição e o ambiente local dos resíduos de aminoácidos aromáticos tirosina e triptofano. Dois grupos de proteínas IgG de substâncias farmacêuticas comerciais foram selecionados com base na similaridade da estrutura primária: 1. Seis (6) proteínas com o mesmo número de resíduos de tirosina e triptofano por molécula e 2. Cinco (5) proteínas com alta similaridade de sequência (93-95% de homologia). Os espectros A-TEEM foram medidos no mesmo tampão em um espectrômetro HORIBA Aqualog. Os perfis A-TEEM foram analisados utilizando uma técnica estatística multivariada denominada Análise de Fatores Paralelos (PARAFAC) para extrair as características reprodutíveis dos perfis de fluorescência. Embora os gráficos A-TEEM pareçam visualmente amplos e sem características definidas, o modelo PARAFAC foi capaz de distinguir essas amostras de IgG. Esta apresentação abordará os resultados da aplicação da espectroscopia A-TEEM e da quimiometria na discriminação de substâncias farmacêuticas biológicas similares para fins de triagem de medicamentos biológicos suspeitos.
Prabuddha Mukherjee – Sartorius Stedim North America, Inc.
Com o início da COVID-19, que teve um enorme impacto em nossa sociedade, a pesquisa na indústria biotecnológica testemunhou uma mudança de paradigma no desenvolvimento de ensaios, monitoramento de culturas celulares, implementação de novas modalidades de imagem e algoritmos analíticos subsequentes para melhor compreensão dos processos e aprimoramento de sua eficácia. Embora o padrão atual de detecção ainda dependa fortemente de ensaios baseados em fluorescência, o impacto químico desses marcadores fluorescentes não pode ser negligenciado. Assim, há uma ênfase significativa no desenvolvimento de estratégias de detecção sem marcadores, que se baseiam exclusivamente na resposta molecular da espécie-alvo. Certas respostas moleculares, como a fluorescência intrínseca dos cofatores NADPH e FAD, rastreiam o estado metabólico das células, enquanto métodos vibracionais são capazes de rastrear a composição química e a distribuição de proteínas, lipídios e ácidos nucleicos nas células. Embora essas estratégias sejam extremamente promissoras, elas frequentemente sofrem com baixo sinal das amostras, o que representa desafios significativos, especialmente como ferramentas analíticas de processo. Aqui, apresentaremos estratégias de detecção multifotônicas sem marcadores (fluorescência e Raman) que são potencialmente promissoras para aplicações em biorreatores. Por fim, descreveremos como essas tecnologias, quando combinadas de forma eficaz com as ferramentas offline atuais, podem oferecer ferramentas analíticas mais confiáveis.
Ashley Love – Universidade de Nottingham
A espectroscopia de fluorescência por matriz de excitação-emissão (EEM) é uma técnica rápida, rica em informações e altamente sensível. Este trabalho explora o potencial dessa abordagem para fornecer insights essenciais sobre parâmetros vitais, como ambientes moleculares, configurações e dinâmicas. Isso é alcançado por meio da análise das informações contidas em uma matriz EEM utilizando uma variedade de métodos multivariados, permitindo-nos obter insights sobre esses parâmetros que frequentemente permanecem ocultos na espectroscopia de fluorescência tradicional.
Outra área em que a espectroscopia de fluorescência EEM é inestimável é no monitoramento de processos, visto que a capacidade de monitorar e otimizar reações em tempo real é de suma importância. Essa capacidade é crucial nos processos de fabricação de princípios ativos farmacêuticos e medicamentos essenciais. Ao combinar espectroscopias ópticas em linha com química de fluxo, torna-se possível monitorar e controlar reações de forma rápida e autônoma, permitindo um controle e otimização de processos eficientes e orientados por algoritmos. Neste trabalho, utilizamos as vantagens da espectroscopia de fluorescência EEM juntamente com uma série de outras técnicas espectroscópicas para monitorar reações em tempo real e otimizar, modelar e analisar métricas-chave de reação de forma autônoma.
John Bobiak - Bristol-Myers Squibb
Meios quimicamente definidos são utilizados em processos biofarmacêuticos para fornecer nutrientes às células, promovendo seu crescimento e produção de proteínas. Ferramentas espectroscópicas desempenham um papel importante na demonstração do controle das propriedades do meio preparado, notavelmente devido à rapidez e simplicidade das medições. A Fluorescência de Excitação-Emissão (EEM) é uma ferramenta espectroscópica que pode ser empregada para detectar variações no meio preparado, impostas durante a preparação do lote e pelo tempo de espera do meio. Modelos semiquantitativos e quantitativos (Mínimos Quadrados Parciais e Análise de Componentes Principais) foram desenvolvidos utilizando a matriz de dados bidimensional remodelada fornecida pela EEM. Tais modelos foram capazes de detectar facilmente diferenças nos procedimentos de preparação do meio, e as tendências observadas nos tempos de espera do meio correlacionaram-se com o desempenho do processo. Além disso, um modelo PLS semiquantitativo para dois aminoácidos foi desenvolvido por meio de adição gravimétrica e aplicado para ilustrar a sensibilidade tanto a erros de formulação quanto à estabilidade do meio. Métodos de EEM indicadores de estabilidade, como o apresentado aqui, são amplamente aplicáveis para monitorar as tendências de atributos críticos de meios preparados em ambientes de desenvolvimento e comerciais.
Michael George – Universidade de Nottingham
A fotoquímica e a eletroquímica são ferramentas potencialmente muito poderosas para a manufatura, principalmente porque a energia é fornecida às moléculas reagentes de maneira muito mais seletiva do que pelo aquecimento em massa, de forma eficiente em termos atômicos. De fato, há mais de um século, Ciamician apresentou uma visão muito poderosa de onde a fotoquímica poderia nos levar [Science 1912, 36, 385-394]. Em comparação, sua penetração na manufatura química permanece relativamente modesta devido a uma série de problemas, principalmente centrados na dificuldade de realizar reações fotoquímicas em larga escala de forma eficiente e segura. Nos últimos anos, temos nos dedicado a alguns dos desafios de tornar a fotoquímica e a síntese eletroquímica mais ecológicas, energeticamente eficientes e amplamente acessíveis. Esta apresentação abordará nossa atividade, particularmente voltada para abordagens genéricas para conectar e ampliar processos de múltiplas etapas no contexto da fotoquímica, eletroquímica e termoquímica em escala de kg/dia, com foco especial em processos contínuos de foto-redox e eletroquímica oxidativa e redutiva, permitindo uma produtividade de 1 a 10 kg/dia em reatores Taylor Vortex com uma área de ocupação muito pequena. Abordagens PAT existentes e novas (Raman, IR e EEMs) são utilizadas em combinação com a auto-otimização autônoma para o desenvolvimento de processos. O principal objetivo é aprimorar a sensibilidade, a especificidade, a faixa dinâmica e a velocidade de aquisição de dados.
Nicole Ralbovsky, PhD – Merck
A Tecnologia Analítica de Processos (PAT, na sigla em inglês) tem sido cada vez mais explorada na indústria farmacêutica de grandes moléculas, com ênfase particular no setor de vacinas. A PAT visa proporcionar maior compreensão e controle do processo por meio do monitoramento em tempo real de atributos críticos de qualidade e parâmetros-chave do processo, bem como da detecção de desvios. A purificação a jusante em processos de fabricação de vacinas pode ser complexa e exigir uma caracterização analítica extensa. Neste trabalho, apresentamos o desenvolvimento de um método de PAT para uso como Controle em Processo durante a fabricação clínica de um princípio ativo de vacina. Além disso, ilustramos como a PAT também pode ser usada para a caracterização rápida de um produto farmacêutico vacinal. No primeiro caso, a espectroscopia UV-Vis SoloVPE é utilizada como um método rápido e preciso para a determinação da concentração total de proteínas; no segundo caso, a imagem hiperespectral Raman com aprendizado de máquina é empregada para a caracterização analítica e compreensão da formulação de um produto farmacêutico. Ambos os trabalhos ilustram as vantagens da PAT no desenvolvimento de processos de vacinas e na fabricação clínica, e indicam a utilidade da PAT para a otimização e o aprimoramento de processos.
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