O telefone tocou às 2h20 da manhã. Era início de outubro de 2012.
Brian Kobilka não se levantou para atender. O médico e pesquisador concluiu que era um engano.
Poucos minutos depois, o telefone tocou novamente.
“Atendi o telefone e era uma mulher com sotaque sueco, dizendo que gostaria que eu falasse com o presidente do comitê de química”, disse Kobilka. “Não era o cenário que eu imaginava para um trote.”
O presidente lhe deu a notícia. O Comitê Nobel escolheu Kobilka e seu mentor, Robert Lefkowitz, MD, como os co-laureados com o Prêmio Nobel de Química de 2012.
"Na verdade, ele enviou parabéns em nome de um cientista sueco que eu conheço, e ninguém teria pensado nisso."
Em menos de 15 segundos, tudo se tornou realidade para Kobilka.
“No início, fiquei em choque. Não tive muito tempo para ser cético. Era plausível porque o processo não ocorreu como eu esperaria se fosse uma farsa.”
Kobilka, nascido em 1955, era professor na Faculdade de Medicina de Stanford quando recebeu a notícia. Ele foi trabalhar naquele dia, mas admitiu que não conseguiu fazer muita coisa.
Tong Sun Kobilka, médica, e seu marido, o ganhador do Prêmio Nobel Brian Kobilka, médico.
Kobilka e Lefkowitz, juntamente com uma grande equipe de colaboradores, descreveram a estrutura e o funcionamento dos receptores acoplados à proteína G (GPCRs). Estes fazem parte de uma grande família de proteínas humanas, que são o alvo de quase metade dos fármacos atuais.
As funções do nosso corpo exigem uma comunicação extensa entre as diferentes partes do organismo. Essa comunicação ocorre eletricamente através dos nervos e, nas extremidades dos nervos, há a liberação de pequenas moléculas chamadas neurotransmissores.
O cérebro regula a função cardiovascular por meio de uma rede especial chamada sistema nervoso autônomo. Os neurotransmissores liberados pelas terminações nervosas no coração podem acelerar ou desacelerar os batimentos cardíacos. Esses neurotransmissores transmitem informações às células do músculo cardíaco ativando receptores acoplados à proteína G (GPCRs) específicos.
Da mesma forma, quando um hormônio é liberado na corrente sanguínea, ele se distribui por todo o corpo e encontra um receptor que responde a esse hormônio.
“Por exemplo, se você tomar insulina em excesso, seu nível de açúcar no sangue cai”, explicou Kobilka. “O pâncreas secreta um hormônio chamado glucagon, que é reconhecido por um GPCR específico na superfície das células do fígado, e o fígado começa a liberar glicose. Assim, os GPCRs transmitem informações de hormônios e neurotransmissores do exterior para o interior da célula, geralmente por meio de proteínas chamadas proteínas G.”
Portanto, um receptor recebe informações de um hormônio ou neurotransmissor que causam alterações estruturais no receptor, o que permite que ele ative proteínas G, que alteram o comportamento da célula.
“Minha contribuição foi determinar a estrutura tridimensional desses GPCRs em estados inativos e ativos, e determinar a estrutura de um GPCR em complexo com sua proteína G”, disse Kobilka.
Agora, os pesquisadores podem usar métodos computacionais para selecionar medicamentos para receptores acoplados à proteína G cujas estruturas já estão disponíveis.
“Desenvolvemos estratégias de engenharia de proteínas para obter estruturas cristalinas de GPCRs”, disse ele. “Assim, após nossas estruturas cristalinas iniciais, muitos outros conseguiram cristalizar GPCRs tanto em estados inativos quanto ativos. Agora, muitas dessas estruturas estão disponíveis, e a triagem de medicamentos baseada em computador é uma abordagem bastante viável para essa família de receptores.”
Os pesquisadores identificaram quase 800 GPCRs diferentes, tornando-os uma das maiores famílias de proteínas humanas. Essas proteínas regulam praticamente todos os processos corporais, incluindo o funcionamento do cérebro e os batimentos cardíacos.
Os medicamentos que atuam nesses receptores incluem fármacos conhecidos como Zyprexa, usado por médicos para tratar esquizofrenia; Clarinex, um anti-histamínico; e Zantac, usado para úlceras estomacais e doença do refluxo gastroesofágico.
Os GPCRs também estão envolvidos em alguns tipos de dependência química, como a dependência de morfina e outros opiáceos. De fato, Kobilka foi coautor de um estudo de 2016 que utilizou uma abordagem baseada na estrutura para identificar um novo fármaco opioide. Em estudos com animais, esse fármaco demonstrou propriedades analgésicas sem a supressão respiratória potencialmente letal.
Kobilka, um introvertido assumido, fala baixo, sem qualquer traço de pretensão. Ele demonstra uma timidez juvenil. Mas sua fala se acelera quando ele fala sobre sua pesquisa ou sua longa lista de colaboradores. Essa é a sua paixão.
Com cerca de 1,85 m de altura, ele é alto e magro, com porte físico de atleta de resistência. Aliás, ele já foi um corredor e ciclista dedicado, tendo inclusive percorrido os Pirineus de bicicleta com o filho durante o Tour de France. Hoje em dia, ele se contenta com uma bicicleta ergométrica para seus treinos em casa.
O escritório de Kobilka não apresenta nenhuma homenagem ou demonstração de sua conquista do Prêmio Nobel.
As paredes de seu escritório compacto incluem uma foto de seus netos e uma pequena obra de arte emoldurada. Um grande quadro branco ocupa boa parte de uma parede, parcialmente coberto por equações e gráficos feitos com canetas coloridas. Mas o que domina o quadro é um desenho feito com caneta verde por suas netas, talvez encobrindo a próxima descoberta do cientista. Kobilka permanece impassível – afinal, ele é um cara discreto.
Ele possui uma lembrança que fica pendurada em sua cadeira: uma camisa comemorativa do campeonato de hóquei da Universidade de Minnesota-Duluth, na cor bordô, autografada na parte inferior por seus professores da época em que ele era aluno lá.
Uma mesa retangular em seu escritório serve de espaço de trabalho para sua esposa, Tong Sun, médica internista, que também trabalha meio período no laboratório. Um associado trabalha em uma sala separada.
Kobilka cresceu em Little Falls, Minnesota, uma cidade com 7.500 habitantes, situada às margens do rio Mississippi.
Seus pais eram donos de uma padaria, e Kobilka e sua irmã trabalharam lá desde os 13 anos. Essa experiência moldou sua personalidade.
A padaria era relativamente grande para uma cidade pequena, com meia dúzia de funcionários em tempo integral e vários estudantes do ensino médio em meio período. Isso lhe dava a oportunidade de observar como seu pai interagia com os outros.
“Eu vi como ele conseguia extrair o melhor de todos por meio de interações pessoais de apoio”, disse Kobilka. “Ele ajudava as pessoas financeiramente se elas precisassem. Só fiquei sabendo disso depois, por meio da minha mãe. Meu pai era generoso e tratava as pessoas com respeito e gentileza. Se incorporei essas características à minha própria personalidade, foi observando como meu pai administrava sua padaria.”
Kobilka se aventurou na pesquisa durante sua graduação em biologia em Duluth, mas se candidatou a faculdades de medicina, além de ter se candidatado a algumas outras vagas de pesquisa como plano B. Ele acabou ingressando na Escola de Medicina de Yale para cursar medicina.
O choque cultural para o estudante do meio-oeste americano acompanhou sua mudança para New Haven, Connecticut. A escola fica localizada na periferia da cidade, onde o crime e a pobreza eram generalizados. A pesquisa fazia parte do currículo, e seu primeiro projeto foi um estudo sobre a dengue em um laboratório na Malásia.
Ele e Tong Sun, que conheceu na Universidade de Minnesota, em Duluth, casaram-se em 1978, após seu primeiro ano em Yale.
O auxílio financeiro que recebeu do programa de Serviço de Saúde Pública exigiu que ele trabalhasse em uma comunidade carente de serviços médicos por três anos após a conclusão de sua residência. Isso o impediu de realizar pesquisa básica. Kobilka optou então por uma residência em medicina interna em St. Louis.
Mas a perda de financiamento para os programas do Serviço de Saúde Pública permitiu que Kobilka reembolsasse sua bolsa de estudos de medicina trabalhando em um hospital universitário por três anos. Isso lhe deu a oportunidade de explorar a pesquisa básica.
Ele se interessou por medicina intensiva, onde os pacientes geralmente se encontravam em estado instável. Os pacientes necessitavam de intervenção urgente, frequentemente com medicamentos que atuavam em receptores acoplados à proteína G. Isso incluía receptores adrenérgicos (de células nervosas) e muscarínicos para regular a frequência cardíaca e a pressão arterial, além de receptores opioides para controlar a dor.
Ele se candidatou e foi aceito em uma bolsa de cardiologia na Universidade Duke, obtendo acesso ao laboratório de Robert Lefkowitz. Na época, o laboratório era conhecido por suas pesquisas inovadoras sobre receptores adrenérgicos. Isso uniu as áreas de pesquisa básica com medicina cardiovascular e de terapia intensiva, que eram centrais para os interesses de Kobilka.
Ele se mudou para um apartamento frio de dois andares perto do laboratório em Durham, Carolina do Norte, frequentemente indo e voltando do laboratório, deixando o carro da família para Tong Sun e seus filhos. O trajeto de ida e volta levava vários quilômetros, dependendo da rota.
Essa foi apenas uma parte de sua transição.
“Ao ingressar no laboratório Lefkowitz, tornei-me a pessoa menos experiente em um grupo de jovens cientistas muito talentosos, composto predominantemente por pós-doutorandos e alguns estudantes de pós-graduação”, escreveu ele. “Eu não estava familiarizado com nenhuma das técnicas utilizadas e ainda não havia me familiarizado com a literatura que antecedeu o trabalho realizado no laboratório Lefkowitz naquela época. Meus colegas eram muito amigáveis, mas também muito ocupados com seus próprios projetos e eu realmente não sabia por onde começar.”
Ele passou um tempo nos Laboratórios Merck, ao norte da Filadélfia, aprendendo biologia molecular com Richard Dixon, onde aprendeu a preparar e analisar bibliotecas de cDNA. Ao retornar para Duke, Kobilka montou um laboratório de biologia molecular dentro do laboratório de Lefkowitz.
O objetivo inicial era analisar bibliotecas preparadas por Dixon. Muitos resultados iniciais revelaram-se interações não específicas com várias sondas, acompanhadas pela euforia e desânimo típicos da pesquisa básica.
O grupo chegou à conclusão de que, após cerca de um ano de tentativas frustradas, os receptores β2AR (receptores adrenérgicos β2) estavam presentes em níveis tão baixos na maioria das células que os pesquisadores poderiam não conseguir isolar um clone a partir de uma biblioteca de cDNA (DNA complementar sintetizado a partir de RNA de fita simples).
Por fim, grupos da Merck e da Duke conseguiram isolar um clone genômico que continha a sequência codificadora completa, sem íntrons – uma molécula de DNA ou RNA que não codifica proteínas e interrompe a sequência dos genes.
Isso levou à clonagem de vários outros genes de receptores adrenérgicos, bem como de um receptor órfão. Esse receptor revelou-se um membro da família dos receptores de serotonina (neurotransmissor). Os clones iniciais apresentavam uma arquitetura comum de sete domínios transmembranares, assim como a rodopsina, um receptor acoplado à proteína G especializado na detecção de luz.
No entanto, os estudos não mostraram como o receptor funcionava em detalhes moleculares. Kobilka começou a pensar em obter uma estrutura cristalina.
Entretanto, o Professor Richard Tsien, Ph.D., havia acabado de se mudar de Yale para a Universidade de Stanford. Ele estava criando um novo Departamento de Fisiologia Molecular e Celular em Palo Alto. Tsien era um palestrante popular e visionário durante os tempos de estudante de medicina de Kobilka em Yale, e Kobilka aceitou um cargo no novo departamento.
O aumento do custo da moradia e a entrada de Tong Sun na faculdade de medicina obrigaram Kobilka a fazer plantões de 48 horas como médico de emergência em um hospital próximo algumas vezes por mês. Mas, com a esposa estudando em tempo integral, isso também lhe deu a oportunidade de passar mais tempo com o filho e a filha, sendo o principal responsável por seus cuidados.
A medicina de emergência, porém, com sua gratificação instantânea, não parece oferecer as mesmas recompensas que o progresso lento da pesquisa básica.
Kobilka discordou.
“Na medicina de emergência ou na medicina intensiva, você recebe muito feedback, então consegue ver, em um curto período de tempo, o resultado da sua intervenção terapêutica”, disse ele. “Assim, você pode fazer julgamentos e ver os pacientes melhorarem.”
“Em termos de pesquisa, se você está fazendo algo realmente desafiador, não pode esperar gratificação instantânea, mas cada pequeno avanço incremental que você faz, como um experimento, pode ser parte de uma grande história. Esse experimento pode acontecer em um curto período e você pode ver algo interessante acontecer. E isso lhe dará uma informação essencial para seguir em frente. Portanto, existem pequenos avanços durante um projeto prolongado que podem ser empolgantes.”
Escola de Medicina de Stanford
Kobilka concentrou-se em duas questões no laboratório:
Kobilka utilizou ratos geneticamente modificados para atingir o primeiro objetivo.
Um rato knockout é um rato de laboratório no qual os pesquisadores inativaram, ou "eliminaram", um gene existente, substituindo-o ou interrompendo-o com um fragmento artificial de DNA.
Juntamente com seu colega Greg Barsh, ele criou linhagens de camundongos nocaute para cinco dos nove genes do receptor adrenérgico, e eles conseguiram determinar suas funções na função cardiovascular e no comportamento.
Para atingir o segundo objetivo, ele precisava ser capaz de produzir grandes quantidades de proteína receptora.
“Em 1993”, disse ele, “conseguimos expressar e purificar quantidades suficientes de β2AR funcional em células de insetos para começar a usar a espectroscopia de fluorescência, uma das técnicas biofísicas mais sensíveis, para investigar a estrutura do receptor. Marcamos o receptor adrenérgico β2 purificado (β2AR) com pequenas sondas fluorescentes sensíveis ao ambiente, geralmente ligando-as a uma única cisteína reativa introduzida em um domínio específico.”
“Usando essa abordagem, conseguimos observar mudanças conformacionais induzidas por ligantes em tempo real. Esses experimentos de fluorescência relativamente simples forneceram informações importantes sobre o caráter dinâmico do β2AR, que, em última análise, orientariam nossas estratégias para cristalizar o β2AR e o complexo β2AR-Gs.”
A estrutura cristalina de uma proteína fornece um modelo ou molde para o sítio de ligação do hormônio e do neurotransmissor. Um computador pode armazenar uma biblioteca virtual de compostos. Os pesquisadores podem testar diversos fármacos e moléculas para verificar se eles se ligam, e então o computador pode classificá-los de acordo com a afinidade de ligação.
Por meio de conquistas incrementais, o grupo de Kobilka conseguiu produzir β2AR suficiente para iniciar os ensaios de cristalografia. O colega de Kobilka em Stanford, Bill Weis, doutor formado em Harvard, ensinou-lhe como configurar os ensaios.
Em 2004, após muitos começos em falso, a equipe conseguiu obter os primeiros cristais do β2AR. Kobilka chamou isso de "um marco importante".
Dan Rosenbaum e Søren Rasmussen, ambos pós-doutorandos, tinham como objetivo cristalizar o β2AR. Posteriormente, obtiveram uma resolução de 3,4 Å (ångström, cada unidade equivalente a 0,1 nm) do complexo β2AR-Fab.
“Esta foi nossa primeira visão da estrutura tridimensional do β2AR, mas uma estrutura com resolução mais alta será divulgada em breve”, disse Kobilka.
E assim foi, por meio de uma colaboração com a Scripps.
Essas primeiras estruturas de β2AR representavam estados inativos. No entanto, o objetivo da equipe era entender como a ligação do agonista leva à ativação da proteína G.
Por meio de uma intensa colaboração utilizando uma variedade de métodos para estudar a ativação da proteína G (Gs) pelo receptor β2AR, Kobilka e seus colegas acumularam os reagentes e a experiência necessários para estabilizar e cristalizar o complexo β2AR-Gs.
A equipe publicou a estrutura cristalina do β2AR-Gs em 2011, juntamente com dois estudos complementares para caracterizar os aspectos dinâmicos da molécula.
“Esses estudos combinados forneceram informações sem precedentes sobre a sinalização de GPCR em nível molecular”, disse ele.
Como a maioria dos pesquisadores, Kobilka não vivenciou um único momento de descoberta monumental. Foi mais um processo, uma abordagem de tentativa e erro.
“Quando um experimento falhava, tentávamos descobrir por que ele falhou”, disse ele. “Porque muitas vezes você aprende algo com isso. Isso ajuda a planejar o próximo experimento.”
A pesquisa básica é acompanhada por uma certa postura, visto que é um processo tão intenso e lento.
“Você tem esses objetivos importantes, como identificar medicamentos novos ou melhores para combater doenças. Mas os passos são muito graduais.”
Não foi necessariamente o desejo de desenvolver um medicamento melhor que motivou Kobilka.
“É simplesmente uma questão de curiosidade, de querer realmente saber como algo funciona”, disse ele. “Em muitos casos, não dá para ficar usando o mesmo método repetidamente. É preciso estar disposto a experimentar métodos nos quais você não é necessariamente especialista. Sempre gostei do fato de ter que aprender muitos métodos e técnicas novas para conseguir resolver esses problemas.”
A espectroscopia era uma delas.
“Você não aprende essas coisas na faculdade de medicina”, disse ele. “Então você encontra colegas que se tornam colaboradores e são generosos o suficiente com seu tempo para te ensinar.”
A equipe de Kobilka realizou diversos experimentos para entender como os receptores interagiam com as proteínas G. Eles utilizaram espectroscopia de fluorescência em estado estacionário, o que os ensinou a tentar estabilizar um receptor para estudos estruturais.
Kobilka utiliza um espectrofluorímetro Fluorolog3/TCSPC (Time-Correlated Single-Photon Counting) em seu laboratório. O instrumento modular consegue analisar propriedades moleculares, químicas e eletrônicas em escala nanométrica.
“Desde o início da minha trajetória em Stanford, eu queria aprender como os GPCRs se parecem em três dimensões”, disse ele. “Levou muito tempo para conseguirmos produzir proteína suficiente para começar a cristalografia. Mas, logo no início, conseguimos produzir proteína suficiente para começar a analisar leituras de baixa resolução da estrutura proteica. E a fluorescência era ideal porque não é preciso muita proteína. Se você consegue marcar a proteína com um pequeno fluoróforo, pode aprender como ela muda de conformação sob diferentes condições.”
A equipe direcionou sondas fluorescentes para a extremidade de um segmento transmembranar que atravessa toda a membrana celular. Eles puderam observar grandes mudanças estruturais na transição, por exemplo, de um antagonista para um agonista e, em seguida, mudanças adicionais na transição de um agonista para um agonista mais proteína G.
“Ao obter esse tipo de informação, esses estudos nos ensinaram muito sobre como essas proteínas eram mais dinâmicas do que pensávamos.”
Espectrofluorômetro modular Fluorolog para estado estacionário e tempo de vida
O comitê do Nobel entrega os Prêmios Nobel em cerimônias realizadas no dia 10 de dezembro de cada ano, aniversário da morte de Alfred Nobel.
Kobilka e os demais laureados com o Prêmio Nobel chegaram a Estocolmo, na Suécia, em dezembro de 2012, poucos dias antes da cerimônia de premiação. Uma semana de festividades e festas na cidade complementa o evento.
“Eles são muito acolhedores e fazem você se sentir realmente especial”, disse ele.
Kobilka acompanhou seus colegas laureados de 2012 nas áreas de física, economia, medicina e literatura. A cidade os tratou como celebridades, até mesmo como heróis. No entanto, apesar de todos os elogios, sua humildade típica do Meio-Oeste permanece.
“É preciso muita sorte para ganhar, porque há muitos cientistas merecedores”, disse ele. “O momento tem que ser o certo. Eles precisam encontrar a combinação ideal de pessoas para compartilhar o prêmio. E eu tive muitos colegas que contribuíram para isso.”
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