• La arquitectura TCSPC por píxel ofrece 24.576 decaimientos simultáneos
• Vidas complejas multicomponentes
• La cinética de decaimiento se adquiere directamente.
• Análisis de muestras con hasta 5 decaimientos exponenciales
• EzTime Image interfaz de software simple y eficiente
• Perfecto para análisis moleculares complejos y sofisticados como la dinámica de células vivas y la detección de biomarcadores para diagnósticos de enfermedades.

Los avances en la tecnología CMOS han llevado al desarrollo de sensores de imagen, basados en matrices de píxeles, donde cada píxel contiene un fotodiodo de avalancha de fotón único (SPAD) y su electrónica de temporización asociada, basada en un convertidor tiempo-digital (TDC).

Esto permite una determinación rápida de la vida útil de la fluorescencia (velocidad de vídeo) basada en la técnica de conteo de fotones individuales correlacionada en el tiempo (TCSPC), realizada de forma independiente en cada píxel (Figura 1).

Figura 1: La pareja SPAD y TDC

Un sensor de imagen de 192 x 128 píxeles, implementado en tecnología CMOS de 40 nm, está incorporado en un microscopio de epifluorescencia de campo amplio. El sensor tiene un factor de relleno del 13% y cada píxel de 18,4 x 9,2 μm contiene un PMS con una resolución <40 ps. Esto permite hasta 24.576 mediciones simultáneas de vida útil de fluorescencia, cada una con 4.096 compartimentos de tiempo. Mediante firmware dedicado y la implementación del software HORIBA EzTime Image, la intensidad de fluorescencia y la vida útil media, así como el diagrama de fasores generado a partir de la medición de imagen TCSPC, pueden mostrarse simultáneamente en tiempo real a velocidades de vídeo (>30 fps) (Figura 2).

Figura 2: Cuatro conjuntos de datos simultáneos presentados

Modos de funcionamiento

El FLIMera está diseñado para su uso con el software de EzTime Image altamente intuitivo de HORIBA. Este software se utiliza para el control de FLIMera, adquisición y análisis de datos. FLIMera proporciona 4 modos de operación.

• Manual– Inicio y fin de adquisición por parte del usuario, proporcionando imágenes de intensidad TCSPC y datos FLIM para análisis a lo largo de la vida.
• Tiempo: tiempo de ejecución definido por el usuario para la adquisición, proporcionando datos de imagen de intensidad TCSPC y FLIM para su análisis de por vida.
• Transmisión a archivo HDF5: los datos TCSPC pueden transmitirse, durante un periodo determinado por el usuario, a un archivo HDF5. Este contiene registros completos para cada fotón en cada píxel, por lo que no se pierde ningún dato, y puede usarse para reconstruir fotogramas para un análisis completo de desintegración.
• Diagrama de fasores: complementando la representación histográfica está la capacidad de mostrar y seleccionar datos de vida útil en forma de un diagrama de fasores en tiempo real, como se ve en la Figura 3. El diagrama de fasores requiere calibración inicial utilizando un estándar de por vida.

Figura 3: Gráfico de fasores

La capacidad de velocidad de vídeo se demuestra utilizando muestras estándar y células de levadura marcadas con FUN-1 (Figura 4).

Figure 4: Sequence of images extracted from FUN-1 labeled yeast cell lifetime video https://youtu.be/1Fu7VOCsHuA

Figura 5 a: Descomposición del sistema de cubetas DeltaFLEX

La figura 5 b: Decaimiento de solo uno de 24.578 píxeles SPAD demuestra la muy alta resolución y fidelidad TCSPC de FLIMera

FLIM y HORIBA

La novedad de la tecnología de detección y temporización en píxel permite un enfoque de imagen de campo amplio, que reduce significativamente los tiempos de adquisición de datos y permite el estudio de eventos dinámicos. FLIMera contribuye a la larga trayectoria de HORIBA en el campo de la medición de fluorescencia; reconocido al ganar el prestigioso Premio a la Innovación Empresarial del Instituto de Física.