A-TEEM ™ combina mediciones simultáneas de absorbancia, transmitancia y matriz de excitación-emisión de fluorescencia en un análisis molecular rápido y no destructivo con gráficos 3D.
El analizador New Veloci Biopharma de HORIBA lleva esta innovación al control de calidad farmacéutica, ofreciendo:
A-TEEM Espectroscopía
A-TEEM Espectroscopía
Trabajos de investigación, pósteres y charlas sobre A-TEEM
Nathan Fuenffinger – Merck & Co., Inc., Jennifer Pai Wang – Merck & Co., Inc., Louis Obando – Merck & Co., Inc.
La identificación posterior al envasado de todos los lotes manufacturados es una disposición general establecida por la Administración de Alimentos y Medicamentos para los productos biológicos que se distribuyan dentro de Estados Unidos. Siendo esta la última prueba antes de que el fabricante pueda liberar un lote, es deseable contar con una técnica analítica rápida, sencilla de usar y logísticamente eficiente. Idealmente, esta técnica permitiría realizar pruebas de identidad en el mismo lugar general donde se realiza el empaquetado para evitar el tiempo de entrega significativo asociado a transferir material a una instalación de pruebas externa.
La espectroscopía simultánea de absorbancia, transmisión y matriz de excitación-emisión de fluorescencia (A-TEEM) es una técnica que tiene el potencial de proporcionar una identificación rápida de productos vacunales. En este estudio, examinamos cerca de 1.100 espectros de 92 lotes de siete productos de vacunas atenuadas de virus vivos formulados de forma similar, utilizando espectroscopía de EEM. El conjunto de datos se visualizó examinando las imágenes de fluorescencia 3D resultantes y realizando análisis exploratorios con análisis de componentes principales. Cada producto de la vacuna parecía dar una huella espectral única, cuya especificidad se derivaba de diferentes intensidades del mismo pico, o de la ausencia o presencia de picos adicionales. Finalmente, se desarrollaron modelos de clasificación utilizando la analogía de la clase de modelado independiente suave (SIMCA) con el propósito de identificar cada producto de la vacuna. Se utilizaron conjuntos externos de prueba y validación que consistían en 84 viales de 42 lotes no utilizados durante la calibración para establecer la precisión de los modelos. En total, los modelos SIMCA alcanzaron una precisión del 100% en la predicción de la identidad de las vacunas en aproximadamente 1.300 casos durante la calibración, prueba y validación, demostrando así que los modelos eran adecuados para su uso previsto.
Nicole Ralbovsky, PhD – Merck
La Tecnología Analítica de Procesos (PAT) se explora cada vez más en los fármacos de moléculas grandes, con especial énfasis en el ámbito de las vacunas. PAT tiene como objetivo proporcionar una mayor comprensión y control de procesos mediante la monitorización en tiempo real de atributos críticos de calidad y parámetros clave del proceso, así como la detección de desviaciones de proceso. La purificación posterior en los procesos de fabricación de vacunas puede ser compleja y requerir una abundante caracterización analítica. Aquí mostramos el desarrollo de un método PAT para su uso como Control en Proceso durante la fabricación clínica de una sustancia medicamentosa para vacunas. Además, ilustramos cómo la PAT también puede utilizarse para la caracterización rápida de un producto medicamentoso vacunal. En el primer caso, la espectroscopía UV-Vis SoloVPE se utiliza como un método rápido y preciso de concentración total de proteínas; en el segundo caso, se emplean imágenes hiperespectrales Raman con aprendizaje automático para la caracterización analítica y la comprensión de la formulación de un producto farmacéutico. Ambos esfuerzos ilustran las ventajas de la PAT en el desarrollo de procesos de vacunas y en la fabricación clínica, y muestran la utilidad de la PAT para la optimización de procesos y la mejora.
Rita C. Barral – Sanofi, Tecnología Analítica de Procesos – Plataforma de Mamíferos, Framingham, Massachusetts, EE. UU., Marina Hincapie – Sanofi, Tecnología Analítica de Procesos – Plataforma de Mamíferos, Framingham, Massachusetts, EE.UU., John Bobiak – Sanofi, Fabricación, Ciencia y Tecnologías – Plataforma de Mamíferos, Framingham, Massachusetts, EE. UU., Esra Kiran – Sanofi, Fabricación, Ciencia y Tecnologías – Plataforma de Mamíferos, Framingham, Massachusetts, EE. UU., Lia Tescione – Sanofi, Fabricación, Ciencia y Tecnologías – Plataforma de Mamíferos, Framingham, Massachusetts, EE. UU.
En bioprocesamiento, una de las áreas de más rápido crecimiento es la Tecnología Analítica de Procesos (PAT), que busca innovar en el desarrollo y fabricación de procesos biológicos. El término PAT abarca una amplia gama de tecnologías analíticas avanzadas, incluyendo analizadores, sensores blandos, sistemas automatizados de muestreo, plataformas de gestión de datos y marcos de automatización. En general, PAT es un enfoque rico en datos que conduce a una mejor comprensión de los procesos porque los resultados se obtienen en minutos o incluso segundos, en lugar de horas o días.
Los medios de cultivo celular utilizados en procesos aguas arriba de mamíferos son soluciones a base de agua que contienen muchos componentes diferentes, de ahí su complejidad. Estos componentes incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, vitaminas y metales, entre otros. Es difícil analizar este tipo de mezclas debido a su naturaleza compleja. Para fines rutinarios de cribado se han empleado técnicas basadas en espectroscopía rápida, específicamente espectroscopía Raman; sin embargo, este método no logra diferenciar tipos de medios de cultivo celular cuando las variaciones solo están en el rango micromolar.
En este estudio, investigamos un método alternativo multiatributo para analizar medios de cultivo celular que ofrecen mayor sensibilidad. Nuestra investigación se centró en el uso de la matriz de excitación-emisión de absorbancia-transmisión (A-TEEM) junto con métodos quimiométricos, como el análisis de factores paralelos (PARAFAC) y los mínimos cuadrados parciales no lineales (NPLS). Con el método creado, pudimos observar cambios composicionales entre diferentes medios de cultivo celular y evaluar la calidad del medio, diferenciando entre muestras caducadas y no caducadas.
En general, A-TEEM podría convertirse en una alternativa más adecuada a los métodos basados en espectroscopía Raman gracias a este estudio, lo que mejoraría enormemente nuestra comprensión de la variabilidad en los medios de cultivo celular.
Lyufei Chen, PhD –HORIBA Instrumentos, Jeffrey Julien –HORIBA Instrumentos
La variabilidad en los medios de cultivo celular afecta significativamente al crecimiento celular, la productividad y el perfil de calidad de las proteínas terapéuticas expresadas. Con la expansión de la industria biofarmacéutica, existe una necesidad creciente de monitorizar la consistencia de los medios de cultivo celular, tanto entre lotes como a lo largo del tiempo. En esta presentación, mostraremos un método novedoso de calificación y cuantificación aplicado a medios celulares disponibles comercialmente. Este método se basa en A-TEEM, una técnica espectroscópica multimodal que integra espectroscopía UV/Vis (A-T para Absorbancia-Transmisión) y fluorescencia 3D (EEM para Matriz de Emisión de Excitación). También introduciremos el uso de PARAFAC (análisis factorial paralelo), que descompone matrices de emisión por excitación de fluorescencia en sus componentes químicos subyacentes. Al combinar A-TEEM con PARAFAC, podemos calificar los medios celulares agrupando y clasificando lotes, así como cuantificar medios celulares para proporcionar información de concentración sobre componentes principales como triptófano, tirosina, piridoxina, ácido fólico y riboflavina. Esta técnica proporcionará una herramienta alternativa sensible para el perfilado de medios celulares, fácil de usar y que requiere una preparación mínima de la muestra.
Alan G. Ryder, PhD (él/él) – Laboratorio de Biofotónica a Escala Nanométrica, Universidad de Galway, Matheus A. de Castro – Laboratorio de Biofotónica a Escala Nanométrica, Universidad de Galway
La poli-N-isopropilacrilamida (PNIPAm), un polímero sensible al termo, altamente soluble en agua por debajo de su Temperatura Crítica Inferior de Solución (LCST), se utiliza ampliamente en aplicaciones biomédicas como la administración de fármacos. Sin embargo, el Nipam es muy propenso a la agregación tanto en estado sólido como en disolución, lo que puede inducir fuentes relativamente inocuas como almacenamiento prolongado en ambientes húmedos y tensiones en la interfaz aire-agua. Por tanto, poder medir de forma rápida, económica y precisa el tamaño y el estado de agregación de PNIPAm en solución es fundamental para aplicaciones donde se requieren proporciones moleculares estequiométricas.
La dispersión dinámica de la luz (DLS) es probablemente la técnica de dimensionamiento de nanopartículas más disponible y económica, pero existen limitaciones en cuanto a la velocidad de medición, concentración y polidispersión que deben considerarse cuidadosamente. También se puede emplear la espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) utilizando fluoróforos covalentes o no covalentes como sondas; sin embargo, existen desventajas en términos de complejidad de medición, manipulación de muestras y concentraciones útiles de muestras.
Sin embargo, hemos comprobado que el PNIPAm disponible comercialmente era intrínsecamente fluorescente, con dos tipos distintos de emisión, presumiblemente procedentes de las moléculas iniciadoras utilizadas durante la síntesis. Midiendo la emisión intrínseca de PNIPAm mediante espectroscopía de matriz de excitación-emisión polarizada (pEEM), se puede obtener una medición más detallada e informativa de los cambios de tamaño en la solución. Las mediciones de pEEM pueden implementarse como modos de polarización paralelos o perpendiculares que, al acoplarse con las señales de dispersión de Rayleigh, proporcionan información útil sobre los cambios en el tamaño de las partículas. Las grandes ventajas del análisis de polímeros pEEM en un contexto industrial son que no tiene etiquetas, requiere un manejo mínimo de muestras y puede implementarse usando fluorómetros convencionales de sobremesa. Aquí mostramos que el tamaño de las partículas PNIPAm (datos de referencia de mediciones DLS) estaba correlacionado (R2>0,9) con la banda de dispersión de Rayleigh de las mediciones polarizadas en paralelo, y que el cambio en las propiedades de emisión durante la agregación proporciona un método conveniente para monitorizar la agregación de polímeros inducida por interfaces aire-agua.
Brendon M. Lyons, Máster en Química – Bristol Myers Squibb, Jeffrey Julien –HORIBA Instrumentos, Lyufei Chen, PhD –HORIBA Instrumentos
Se evaluó la espectroscopía de Matriz de Emisión de Absorbancia - Transmisión y Excitación (A-TEEM) para una aplicación novedosa de cribado de productos biológicos falsificados. Algunos productos biológicos falsificados son difíciles de detectar con herramientas analíticas rápidas y económicas. Por ejemplo, los biológicos auténticos del BMS que son falsificados por desviación del mercado (es decir, contrabando) requieren métodos analíticos muy específicos para verificar su autenticidad y garantizar la seguridad del paciente. Sin embargo, las técnicas tradicionales de mapeo péptdico son demasiado lentas, costosas y laboriosas para detectar productos sospechosos en un laboratorio forense de alto rendimiento. Se realizó un estudio de prueba de principio en colaboración con el proveedor de instrumentos analíticos, HORIBA, para evaluar la especificidad de A-TEEM para estructuras similares de la inmunoglobulina G (IgG). A-TEEM es una técnica espectroscópica tridimensional que puede caracterizar la composición y el entorno local de los residuos de aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano. Se seleccionaron dos grupos de proteínas IgG de sustancias farmacéuticas comerciales basándose en la similitud de la estructura primaria: 1. Seis (6) proteínas con el mismo número de residuos de tirosina y triptófano por molécula y 2. Cinco (5) proteínas con alta similitud de secuencias (93-95% homólogas). Los espectros A-TEEM se midieron en el mismo buffer de un espectrómetro HORIBA Aqualog. Los perfiles de A-TEEM se analizaron utilizando una técnica estadística multivariante llamada Análisis Factorial Paralelo (PARAFAC) para extraer las características reproducibles de los perfiles de fluorescencia. Aunque los gráficos de A-TEEM parecen visualmente amplios y sin rasgos, el modelo PARAFAC pudo distinguir estas muestras de IgG. Esta charla presentará los resultados de la aplicación de la espectroscopía A-TEEM y la quimiometría para la discriminación de sustancias biológicas similares con el fin de realizar el cribado sospechoso de fármacos biológicos.
Prabuddha Mukherjee – Sartorius Stedim North America, Inc.
Con la llegada de la COVID, que ha dejado un gran impacto en nuestra sociedad, la investigación en la industria biotecnológica ha visto un cambio de paradigma en el diseño de ensayos, el seguimiento de cultivos celulares, la implementación de nuevas modalidades de imagen y los posteriores algoritmos analíticos para una mejor comprensión de los procesos y mejora su eficacia. Aunque el estándar actual para la detección sigue dependiendo en gran medida de ensayos basados en fluorescencia, no se puede pasar por alto el impacto químico de estas etiquetas fluorescentes. Por ello, se pone un énfasis significativo en diseñar estrategias de detección sin etiqueta, que dependan únicamente de la respuesta molecular de la especie objetivo. Ciertas respuestas moleculares como la fluorescencia intrínseca de cofactores NADPH y FAD rastrean el estado metabólico de las células, mientras que los métodos vibracionales pueden rastrear la composición química y la distribución de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos en las células. Aunque estas estrategias son extremadamente prometedoras, a menudo sufren de una baja señal por las muestras, lo que supone desafíos significativos, especialmente como herramientas analíticas de procesos. Aquí presentaríamos estrategias de detección sin marcas multifotónicas (fluorescencia y Raman) que pueden ser prometedoras para aplicaciones en biorreactores. Por último, describiremos cómo estas tecnologías, combinadas eficazmente con las herramientas offline actuales, pueden ofrecer herramientas analíticas más fiables
Ashley Love – Universidad de Nottingham
La espectroscopía de fluorescencia de matriz de emisión de excitación es una técnica rápida, que no solo es "rica" en información, sino también muy sensible. Este trabajo explora el potencial que ofrece este enfoque para proporcionar información clave sobre parámetros vitales, como los entornos moleculares, las configuraciones y la dinámica. Esto se logra analizando la información contenida en un EEM utilizando una variedad de métodos multivariantes, lo que nos permite obtener información sobre estos parámetros que a menudo están ocultos en la espectroscopía de fluorescencia tradicional.
Otra vía en la que la espectroscopía de fluorescencia EEM es invaluable es la monitorización de procesos, ya que la capacidad de monitorizar y optimizar reacciones en tiempo real es de suma importancia. La capacidad para hacer esto es fundamental en los procesos de fabricación de agentes farmacéuticos activos y medicamentos esenciales. Al combinar espectroscopías ópticas en línea con química de flujos, se hace posible la capacidad de monitorizar y controlar reacciones de forma autónoma rápidamente, permitiendo un control y optimización de procesos eficientes y impulsados por algoritmos. Aquí utilizamos las ventajas de la espectroscopía de fluorescencia electromagnética junto con una variedad de otras técnicas espectroscópicas para monitorizar reacciones en tiempo real y optimizar, modelar y sondar de forma autónoma métricas clave de reacción.
John Bobiak - Bristol-Myers Squibb
Los medios definidos químicamente se utilizan en procesos biofarmacéuticos para suministrar nutrientes a las células para el crecimiento y la producción de proteínas. Las herramientas espectroscópicas pueden desempeñar un papel importante en la demostración del control de las propiedades del medio preparado, destacando por su velocidad de medición y simplicidad. El Fluoresceso de Excitación-Emisión (EEM) es una herramienta espectroscópica que puede emplearse para detectar variaciones del medio preparado impuestas durante la preparación por lotes and.pr por el tiempo de retención del medio. Se desarrollaron modelos semicuantitativos y cuantitativos (Análisis de Mínimos Cuadrados Parciales y Análisis de Componentes Principales) utilizando la matriz de datos bidimensional remodelada proporcionada por el EEM. Estos modelos pudieron detectar fácilmente diferencias en los procedimientos de preparación del medio, y las tendencias de puntuación observadas en tiempos de retención medios correlacionaron el rendimiento del proceso. Además, se desarrolló un modelo PLS semicuantitativo para dos aminoácidos mediante spiking gravimétrico, y se aplicó para ilustrar la sensibilidad tanto a errores de formulación como a la estabilidad del medio. Los métodos EEM indicadores de estabilidad como el que se muestra aquí son ampliamente aplicables a atributos críticos de medios preparados por tendencias en entornos de desarrollo y comerciales.
Michael George – Universidad de Nottingham
La fotoquímica y la electroquímica son herramientas potencialmente muy potentes para la fabricación, no solo porque la energía se entrega a las moléculas reaccionantes de forma mucho más selectiva que por calentamiento masivo de forma eficiente para los átomos. De hecho, hace más de un siglo, Ciamiciano presentó una visión muy poderosa de hacia dónde podría llevarnos la fotoquímica [Science 1912, 36, 385-394]. En comparación, su penetración en la fabricación química sigue siendo relativamente modesta debido a toda una serie de problemas, principalmente centrados en los problemas de llevar a cabo reacciones fotoquímicas a gran escala de manera eficiente y segura. En los últimos años hemos abordado algunos de los retos para hacer que la fotoquímica y la síntesis electroquímica sean más ecológicas, eficientes energéticamente y más accesibles. Esta presentación cubrirá nuestra actividad, enfocándose especialmente en enfoques genéricos para enlazar y escalar procesos de varios pasos en el contexto de foto-química, electro- y térmica a escala kg/día, centrándose especialmente en procesos foto-redox continuos y electroquímicos oxidativos y reductivos que permiten una productividad de 1-10 kg/día en reactores de vórtices Taylor con huella muy pequeña. Se utilizan enfoques PAT existentes y nuevos (Raman, IR y EEMs) en combinación con la autooptimización autónoma para el desarrollo de procesos. El objetivo principal se centra en mejorar la sensibilidad, la especificidad, el rango dinámico y la velocidad de adquisición de datos.
Nicole Ralbovsky, PhD – Merck
La Tecnología Analítica de Procesos (PAT) se explora cada vez más en los fármacos de moléculas grandes, con especial énfasis en el ámbito de las vacunas. PAT tiene como objetivo proporcionar una mayor comprensión y control de procesos mediante la monitorización en tiempo real de atributos críticos de calidad y parámetros clave del proceso, así como la detección de desviaciones de proceso. La purificación posterior en los procesos de fabricación de vacunas puede ser compleja y requerir una abundante caracterización analítica. Aquí mostramos el desarrollo de un método PAT para su uso como Control en Proceso durante la fabricación clínica de una sustancia medicamentosa para vacunas. Además, ilustramos cómo la PAT también puede utilizarse para la caracterización rápida de un producto medicamentoso vacunal. En el primer caso, la espectroscopía UV-Vis SoloVPE se utiliza como un método rápido y preciso de concentración total de proteínas; en el segundo caso, se emplean imágenes hiperespectrales Raman con aprendizaje automático para la caracterización analítica y la comprensión de la formulación de un producto farmacéutico. Ambos esfuerzos ilustran las ventajas de la PAT en el desarrollo de procesos de vacunas y en la fabricación clínica, y muestran la utilidad de la PAT para la optimización de procesos y la mejora.
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