La microscopía Raman confocal se refiere a la capacidad de filtrar espacialmente el volumen de análisis de la muestra, en los ejes XY (lateral) y Z (profundidad).
La microscopía Raman acopla un espectrómetro Raman a un microscopio óptico estándar, permitiendo la visualización de alta magnificación de una muestra y el análisis Raman con un punto láser microscópico. La microscopía Raman es sencilla: simplemente coloca la muestra bajo el microscopio, enfoca y realiza una medición.
Simplemente añadir un microscopio a un espectrómetro Raman no proporciona un volumen de muestreo controlado; para ello se requiere un filtro espacial. La microscopía Raman confocal se refiere a la capacidad de filtrar espacialmente el volumen de análisis de la muestra, en los ejes XY (lateral) y Z (profundidad).
Hoy en día se utilizan varios métodos (por ejemplo, apertura confocal verdadera o técnicas de fenda en ranura pseudo confocal) y algunos son mejores que otros. Sin embargo, está bien establecido que utilizando un microscopio Raman confocal verdadero, es posible analizar partículas individuales o capas con dimensiones tan bajas como 1 μm o inferiores.
Para un diseño confocal verdadero, la resolución espacial típica está en el orden de 0,5-1 μm.
Para un diseño confocal verdadero, los límites de la resolución espacial se definen principalmente por la longitud de onda y calidad del haz láser que se utiliza, y el tipo de objetivo de microscopio seleccionado, etc. Para la mayor resolución espacial, un objetivo de alta ampliación correctamente ajustado y una excitación láser visible suelen producir resultados óptimos. La resolución espacial típica es del orden de 0,5-1 μm.
Como su nombre indica, el análisis Raman remoto in situ es un método para analizar una muestra in situ y/o en una ubicación remota, en lugar de tener que extraer parte de la muestra y llevarla a un espectrómetro Raman. Se utiliza a menudo en entornos industriales, donde ejemplos incluyen la monitorización de componentes de reacción en un recipiente de reacción (desde un pequeño frasco de vidrio hasta reactores a escala industrial) y el análisis de productos químicos en múltiples posiciones en tuberías.
El Raman remoto in situ suele realizarse mediante fibras ópticas, lo que permite acoplar una cabeza de sonda Raman a un espectrómetro (que puede estar a cientos de metros del punto de análisis). Se utiliza un solo cable para transmitir el láser a la muestra, mientras que otra fibra se utiliza para transferir la señal Raman de la muestra a un espectrómetro y sistema de detección estándar. Estos dos cables están conectados a una cabeza de sonda Raman compacta y robusta que enfoca el láser sobre la muestra y recoge la señal Raman.
Las sondas son adecuadas para su uso a altas temperaturas y presiones. Pueden funcionar en modo de inmersión (donde la cabeza de análisis se sumerge dentro del líquido de reacción) o en modo de separación (donde el análisis se realiza enfocando el láser a través de una ventana transparente en el recipiente o tubería de reacción).
El análisis Raman in situ puede utilizarse para:
La espectroscopía Raman por transmisión (o TRS) es una forma de análisis Raman que es ideal para el análisis masivo de materiales opacos/turbios
La espectroscopía Raman por transmisión (o TRS) es una forma de análisis Raman que es ideal para el análisis masivo de materiales opacos/turbios. El Raman de transmisión se basa en la recogida de luz Raman que se propaga a través de la muestra en dirección al láser de excitación; en esencia, la muestra se ilumina con el láser de excitación por un lado y la señal Raman se recoge por el otro.
A pesar de que la muestra es opaca, la luz del láser puede atravesar la muestra mediante procesos de dispersión de luz. Muchos de estos fotones contienen información Raman, por lo que es posible la espectroscopía Raman de transmisión.
A diferencia de los espectrómetros Raman tradicionales y los sistemas de microscopio, la geometría de transmisión permite un análisis real a granel desde todo el volumen de la muestra (por ejemplo, una tableta farmacéutica).
El Raman de transmisión es sin contacto, no invasivo y no destructivo. No requiere preparación de muestras. Es importante destacar que la medición es insensible a los efectos del tamaño de las partículas, la homogeneidad y la orientación de la muestra.
La espectroscopía Raman de transmisión puede utilizarse para comprender:
La espectroscopía Raman por resonancia es una variante de la espectroscopía Raman 'normal'. La espectroscopía Raman 'normal' utiliza excitación láser a cualquier longitud de onda para medir la dispersión Raman de esta luz láser.
A pesar de los muchos problemas prácticos causados por el uso de diferentes longitudes de onda láser, el resultado final será muy similar a la longitud de onda que se utilice.
En el Raman de resonancia, la longitud de onda de excitación se elige cuidadosamente para solaparse (o estar muy cerca de) una transición electrónica, lo que normalmente significa en un área de absorción visible por los rayos UV. Esta superposición puede resultar en intensidades de dispersión que aumentan entre 102 y 106; por tanto, los límites de detección y los tiempos de medición pueden mejorarse significativamente. Sin embargo, dado que la excitación coincide con la absorción UV visible, los fondos de fluorescencia pueden ser significativos y más problemáticos que con la dispersión Raman 'normal'.
Un enfoque alternativo es la Dispersión Raman Mejorada por la Superficie (SERS), que ofrece aumentos de intensidad de orden de magnitud similares. La ventaja del SERS sobre el Raman por resonancia es que la fluorescencia se suprime mientras el Raman se potencia, eliminando así el problema de fondo de fluorescencia del Raman por resonancia.
Para ciertas aplicaciones específicas, los beneficios del Raman por resonancia pueden ser muy potentes. Un ejemplo de ello es el uso de Raman por resonancia para el análisis de contaminantes ambientales, donde se pueden detectar concentraciones en el rango de partes por billón (ppb) y partes por millón (ppm).
Prácticamente, el Raman de resonancia puede explorarse en cualquier sistema Raman, y la medición real se realiza de la manera estándar. El requisito obvio es tener una excitación láser adecuada para cumplir con las condiciones de resonancia.
La configuración de transmisión permite el uso de los objetivos de mayor apertura numérica (NA) (incluidos los objetivos de inmersión). La configuración de reflexión puede usarse para cualquier tipo de muestras (opacas y transparentes), pero está limitada a objetivos de menor NA.
TERS (Espectroscopía Raman Mejorada por Punta) lleva la espectroscopía Raman a la imagen de resolución nanométrica. TERS es una técnica química de superresolución. Mejor aún, es una técnica de imagen súper resolución sin etiqueta que ha sido ampliada por nuestra novedosa tecnología hasta convertirse en una tecnología de imagen nueva e importante.
TERS imagen se realiza con un sistema AFM/Raman, donde un microscopio de sonda de barrido (SPM que puede usarse en modo de fuerza atómica, túnel de barrido o normal/de fuerza cortante) se integra con un espectrómetro Raman confocal mediante un acoplamiento optomecánico. El microscopio de sonda de barrido permite la obtención de imágenes a escala nanométrica, el acoplamiento óptico lleva el láser de excitación a la punta funcionalizada (o sonda), y el espectrómetro analiza la luz Raman (o de otro modo dispersada) proporcionando una imagen hiperespectral con contraste químico a escala nanométrica.
Un sistema TERS se basa en una punta metálica (generalmente de oro o plata) empleada para concentrar el campo de luz incidente en el vértice. La punta actúa como una fuente nano de luz y potenciador local del campo, mejorando considerablemente la sensibilidad Raman (por un factor de 103–107) y reduciendo el volumen sondeado a la región "nano" inmediatamente debajo de la punta. El acoplamiento óptico que combina ambos instrumentos utiliza un esquema confocal. Existen dos configuraciones diferentes para este acoplamiento: una en transmisión y otra en reflexión (Fig. 28), con sus propias ventajas y desventajas.
La configuración de transmisión permite el uso de los objetivos de mayor apertura numérica (NA) (incluidos los objetivos de inmersión), lo que proporciona una alta densidad de potencia en el punto de enfoque y permite la obtención de altos niveles de señal, pero solo puede usarse para muestras transparentes. La configuración de reflexión puede usarse para cualquier tipo de muestras (opacas y transparentes), pero está limitada a objetivos de menor NA.
Combinando el escaneo punto por punto con la adquisición simultánea de espectro, se pueden realizar mapeos Raman de campo cercano con resolución lateral de hasta diez nanómetros o menos.
Los dispositivos Raman de transmisión para aplicaciones farmacéuticas están disponibles en lugares distintos de Estados Unidos, Europa e India.
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