Espectro Raman de la aspirina, tiempo de adquisición: 1s
El tiempo de adquisición depende de varios factores, como la propia muestra, la calidad espectral deseada y el espectrómetro Raman que se utiliza. Sin embargo, los espectrómetros Raman modernos típicos pueden adquirir espectros Raman de buena calidad en pocos segundos.
Los experimentos de mapeo/imagen Raman, que adquieren miles de espectros, tardan más, y normalmente los tiempos totales de adquisición pueden ser del orden de unos minutos a varias horas. Esto dependería del número de datos que se obtengan, además de los otros factores mencionados anteriormente.
Accesorio MultiWell para análisis de alto rendimiento
Dado que la espectroscopía Raman es una técnica sin contacto no destructiva, puede utilizarse eficazmente para el cribado automatizado de alto rendimiento (HTS) y mediciones de ensayo. Las aplicaciones típicas incluyen el análisis de líquidos/polvos en placas multipozo, cribado con cristales y ensayos de contenido/uniformidad de tabletas con Transmission Raman.
Los sistemas Raman de Cribado de Alto Rendimiento (HTS) utilizan una combinación de movimiento automatizado de muestras, dispositivos de autoenfoque y procedimientos automatizados de adquisición y análisis de datos para adquirir espectros de cientos de muestras de forma secuencial. El cribado HTS y las mediciones automatizadas incluso pueden integrarse con un manejo completo del robot, eliminando la necesidad de experiencia y intervención del operador.
Aplicaciones como los recubrimientos de carbono tipo diamante (DLC) para discos duros por ordenador, y el análisis de cristales y polimorfos en el desarrollo de fármacos utilizan ahora espectroscopía Raman para cribado automatizado, así como muchas otras aplicaciones que simplemente requieren análisis rutinarios de grandes cantidades de muestras.
Dado que Raman es una técnica de dispersión de luz, es posible transferir tanto la luz de excitación láser como la señal Raman a través de cables de fibra óptica. Se utiliza un solo cable para transmitir el láser a la muestra, mientras que otra fibra se utiliza para transferir la señal Raman de la muestra a un espectrómetro y sistema de detección estándar. Estos dos cables están conectados a una cabeza de sonda Raman compacta y robusta que enfoca el láser sobre la muestra y recoge la señal Raman.
La generación actual de sondas Raman puede usarse para muestreo remoto a cientos de metros del analizador base Raman. Además, se pueden conectar múltiples sondas a un solo sistema analizador, proporcionando un método rentable para monitorizar la composición química en varios puntos dentro de una planta.
Las sondas son adecuadas para su uso a altas temperaturas y presiones. Pueden funcionar en modo de inmersión (donde la cabeza de análisis se sumerge dentro del líquido de reacción) o en modo de separación (donde el análisis se realiza enfocando el láser a través de una ventana transparente en el recipiente o tubería de reacción).
El análisis Raman remoto puede utilizarse para:
Espectros de referencia Raman y mapas Raman de diferentes jabones industriales.
Raman es una técnica de análisis químico sin contacto no destructiva, que puede aplicarse al análisis in vivo. Normalmente esto se realiza utilizando una sonda Raman remota compacta, acoplada al espectrómetro y al láser mediante cables flexibles de fibra óptica.
Existen muchos ejemplos de análisis in vivo, especialmente en el análisis de medicamentos cosméticos y tópicos en la piel. La investigación actual estudia la aplicación de la espectroscopía Raman in vivo en entornos quirúrgicos, donde puede usarse como indicador inmediato de la salud tisular.
Raman es muy adecuado para el análisis de muestras acuosas (incluyendo soluciones y materiales biológicos como tejidos y células). El agua tiene una dispersión Raman muy débil y, típicamente, es mucho más débil que otros materiales. Además, el espectro del agua es muy simple, con solo un pequeño número de picos, por lo que hay una mínima interferencia con los picos del soluto.
Por tanto, el análisis de un soluto en solución acuosa es fácilmente posible, ya que en la mayoría de los casos la intensidad máxima del soluto será más fuerte que la del agua, incluso cuando el agua está en gran exceso.
El tamaño de la mancha láser se define principalmente por la longitud de onda láser y el objetivo del microscopio que se utiliza. El tamaño mínimo de punto alcanzable es limitado por difracción, según las leyes de la física y la óptica.
Diámetro del punto láser = 1,22 λ / NA
donde λ es la longitud de onda del láser, y NA es la apertura numérica del objetivo del microscopio que se está utilizando. Por ejemplo, con un láser de 532 nm y un objetivo de 0,90/100x, el diámetro teórico del punto será de 721 nm.
De esta ecuación se puede ver que los láseres de longitud de onda más baja ofrecen una mayor resolución espacial (por ejemplo, un láser azul a 488 nm tendrá un tamaño de punto menor que un láser infrarrojo a 785 nm si se usa el mismo objetivo), al igual que objetivos de alta NA (por ejemplo, un objetivo de 0,90/100x dará un punto más pequeño que uno de 0,55/50x).
Una ecuación ligeramente modificada da como resultado la resolución espacial teórica limitada por difracción, que es alcanzable usando un microscopio óptico:
Resolución espacial = 0,61 λ / NA
Para un láser de 532 nm con un objetivo de 0,90/100x, esto predeciría una resolución espacial de 361 nm. Sin embargo, aunque esta ecuación es aplicable a la microscopía óptica estándar, los procesos ópticos que ocurren durante la microscopía Raman son mucho más complejos. Por ejemplo, la dispersión de los fotones láser/Raman y la interacción con las interfaces en la muestra pueden reducir esta resolución. Así, la resolución espacial típica Raman suele citarse como del orden de 1 μm, mientras que con muestras 'buenas' se puede alcanzar una resolución espacial cercana al límite de difracción.
Ciertos sistemas, como el LabRAM HR, pueden configurarse con óptica adaptativa como el DuoScan™, que permiten crear puntos láser que pueden tener dimensiones de hasta 270 x 270 μm 2 (dependiendo del objetivo utilizado).
Los microscopios Raman estándar están limitados a tamaños de punto del orden de 0,5-10 μm (dependiendo de la longitud de onda láser y el objetivo utilizado), lo que se debe al recorrido óptico del haz láser colimado a través del objetivo. Aunque estos tamaños de punto pequeños son ideales para el análisis de características microscópicas y ofrecen una excelente resolución espacial cuando se combinan con óptica confocal real, pueden limitarse para análisis masivo o macroscópico.
Resolución espacial de un microscopio Raman: imagen 3D de película de enmascaramiento de laminado polimérico
La resolución espacial alcanzable se define principalmente por la longitud de onda láser y el objetivo del microscopio que se utiliza. La resolución espacial teórica limitada por difracción, según las leyes de la física y la óptica, se define mediante la siguiente ecuación:
Resolución espacial = 0,61 λ / NA
donde λ es la longitud de onda del láser, y NA es la apertura numérica del objetivo del microscopio que se está utilizando.
Para un láser de 532 nm con un objetivo de 0,90/100x, esto predeciría una resolución espacial de 361 nm. Sin embargo, aunque esta ecuación es aplicable a la microscopía óptica estándar, los procesos ópticos que ocurren durante la microscopía Raman son mucho más complejos. Por ejemplo, la dispersión de los fotones láser/Raman y la interacción con las interfaces en la muestra pueden reducir esta resolución. Así, la resolución espacial típica Raman suele citarse como del orden de 1 μm, mientras que con muestras 'buenas' se puede alcanzar una resolución espacial cercana al límite de difracción.
De esta ecuación se puede ver que los láseres de longitud de onda más baja ofrecen una mayor resolución espacial (por ejemplo, un láser azul a 488 nm tendrá un tamaño de punto menor que un láser infrarrojo a 785 nm si se usa el mismo objetivo), al igual que los objetivos de alta NA (por ejemplo, un objetivo de 0,90/100x dará un punto más pequeño que uno de 0,55/50x).
Resolución espacial de un microscopio Raman: mapeo Raman de características semiconductoras de 250 nm y 350 nm.
Nótese que la ecuación anterior se relaciona con la resolución espacial lateral (XY). La resolución espacial de profundidad (Z) es más compleja y depende en gran medida del diseño confocal del microscopio Raman que se utilize. Hoy en día se utilizan varios métodos, algunos realmente confocales, otros pseudo-confocales, que funcionan con éxito variable.
Para un diseño verdaderamente confocal (que incorpora una apertura estenopeica confocal totalmente ajustable) es posible una resolución de profundidad del orden de 1-2 μm, permitiendo analizar discretamente capas individuales de una muestra. La resolución de profundidad alcanzable dependerá en gran medida de la longitud de onda del láser, el objetivo del microscopio y la estructura de la muestra.
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