Presentación del instrumento

Longitudes de onda láser que van desde ultravioleta hasta visible hasta infrarrojo cercano pueden utilizarse para espectroscopía Raman. Ejemplos típicos incluyen (pero no se limitan a):

• Ultravioleta: 244 nm, 266 nm, 320 nm, 355 nm, 405 nm
• Visible: 458 nm, 473 nm, 515 nm, 532 nm, 594 nm, 633 nm, 660 nm
• Infrarrojo cercano: 785 nm, 830 nm, 980 nm, 1064 nm

La elección de la longitud de onda del láser tiene un impacto importante en las capacidades experimentales:

Sensibilidad

La intensidad de dispersión Raman es proporcional a ^λ-4, donde λ es la longitud de onda del láser. Así, un láser infrarrojo provoca una disminución de la intensidad de dispersión por un factor de 15 o más, en comparación con los láseres visibles azul/verde.

Resolución espacial                   

El diámetro del punto láser limitado por difracción puede calcularse según la ecuación, diámetro = 1,22 λ/NA (donde λ es la longitud de onda del láser y NA es la apertura numérica del objetivo del microscopio utilizado). Por ejemplo, con un láser de 532 nm y un objetivo de 0,90/100x, el diámetro teórico del punto será de 0,72 μm; con el mismo objetivo, un láser de 785 nm produciría un diámetro teórico de punto de 1,1 μm. Por tanto, la resolución espacial alcanzable depende en parte de la elección del láser. 

Optimización del resultado basada en el comportamiento de la muestra

Por ejemplo:

• Los láseres azules o verdes pueden ser buenos para materiales inorgánicos y experimentos Raman de resonancia (por ejemplo, para nanotubos de carbono y otros materiales de carbono) y para la Dispersión Raman Mejorada en Superficie (SERS).
• El rojo o el infrarrojo cercano (660-830 nm) son buenos para la supresión de fluorescencia.
• Láseres ultravioleta para resonancia Raman en biomoléculas (como proteínas, ADN y ARN) y supresión de fluorescencia.

Los láseres ultravioleta (UV) para espectroscopía Raman suelen incluir longitudes de onda láser que van desde 244 nm hasta 355 nm.

Teóricamente, la espectroscopía Raman UV no difiere del análisis estándar que utiliza longitudes de onda láser visibles. Sin embargo, en la práctica existen varias dificultades y desventajas prácticas que deben considerarse.

Ventajas

• Con ciertas muestras, la excitación láser UV puede interactuar de formas que no son posibles al usar fuentes láser visibles. Por ejemplo, en materiales semiconductores, la profundidad de penetración de la luz UV suele ser del orden de unos pocos nanómetros, por lo que el Raman UV puede utilizarse para analizar selectivamente desde una capa superficial delgada (como es común en el silicio sobre materiales SOI aislantes). En otro ejemplo, la excitación UV puede dar lugar a un aumento específico de resonancia con partes biológicas, especialmente estructuras de proteínas, ADN y ARN. El análisis específico de estos materiales dentro del tejido puede ser difícil utilizando longitudes de onda láser visibles.

• La supresión de fluorescencia a menudo puede ser asistida mediante láseres UV, separando espectralmente las firmas Raman y fluorescente. Con los láseres visibles es común que se superpongan Raman y fluorescencia, y la intensidad incomparable de la fluorescencia es lo que puede perturbar (o enmascarar completamente) el espectro Raman. Con la excitación UV, el espectro Raman se encuentra cerca de la línea láser, mientras que la fluorescencia suele estar ligeramente desplazada a longitudes de onda superiores. Por tanto, ya no se solapan y la fluorescencia deja de ser un problema.

• La mayor sensibilidad puede deberse a la excitación UV, ya que la eficiencia de dispersión Raman es proporcional a ^λ-4, donde λ es la longitud de onda del láser. Así, la dispersión Raman a 325 nm es un factor 14 veces más eficiente que la de 633 nm.

Desventajas

• El UV Raman sigue siendo una técnica más sofisticada que requiere mayor experiencia para manejarla. Las razones de esto incluyen el hecho de que el haz láser ahora es invisible, y que los láseres son más grandes, complejos y considerablemente más caros.

• Las muestras son más propensas a quemarse y degradarse por el haz láser, ya que aumenta la energía por fotón. Sin embargo, nuevas técnicas como la óptica DuoScan™ permiten que el haz láser se rastere rápidamente sobre la muestra y así evitar la quema inmediata. Por ejemplo, la celulosa arde con excitación de 325 nm en pocos milisegundos, pero con DuoScan™ sigue siendo resistente a la combustión durante más de cinco minutos.

• Muchos sistemas Raman diseñados para análisis en el infrarrojo visible y cercano no son adecuados para el Raman UV. El Raman UV requiere recubrimientos espejo específicos, objetivos de microscopio, redes de difracción y un detector CCD para obtener resultados optimizados. Sistemas modernos como el LabRAM HR pueden configurarse para funcionar eficientemente desde el UV hasta el infrarrojo sin comprometer, pero aun así los requisitos adicionales tienen un coste.

Los láseres en infrarrojo cercano (NIR) para Raman suelen incluir un rango de longitudes de onda superiores a 700 nm, como 785 nm, 830 nm, 980 nm y 1064 nm. La razón principal para el uso de la NIR Raman es la supresión de la fluorescencia, pero hay una serie de inconvenientes que deben considerarse. Aunque a veces el NIR Raman es invaluable, ciertamente no debe considerarse la mejor solución para cada muestra.

Ventajas

• La supresión de fluorescencia a menudo puede ser asistida mediante láseres NIR. La fluorescencia es un proceso de dos fotones, que primero requiere la absorción de un fotón, seguida por la emisión de un fotón fluorescente. Por otro lado, Raman es un proceso de dispersión de un solo fotón, que no requiere absorción. Aunque muchos materiales absorben en la región visible, menos lo hacen en la región NIR. Así, en muchos casos los láseres NIR no generarán fluorescencia (ya que no se produce absorción), pero la dispersión Raman estará presente como es normal. En casos donde las muestras fluorescen fuertemente con excitación visible, el RAMAN NIR puede proporcionar una solución y permitir que aún se obtenga un buen espectro Raman.

Desventajas

• La disminución de la sensibilidad puede deberse a la excitación NIR, ya que la eficiencia de dispersión Raman es proporcional a ^λ-4, donde λ es la longitud de onda del láser. Así, la dispersión Raman a 785 nm es casi un factor 5 veces menos eficiente que a 532 nm. Este problema se agrava por la disminución de la sensibilidad del detector CCD en el rango de NIR Raman. Como resultado, los tiempos de medición suelen aumentarse considerablemente para obtener una calidad espectral similar a la de las mediciones realizadas con láseres visibles.

• Los láseres NIR suelen tener cualidades de haz (por ejemplo, ancho y divergencia del haz) que no son tan adecuadas para la microscopía. El resultado es que la resolución espacial puede verse algo comprometida y, por tanto, los resultados alcanzables pueden no cumplir con las predicciones teóricas.

Existen dos clases principales de filtros utilizados en espectroscopía Raman.

Filtros ópticos

Estos componentes ópticos se colocan en la trayectoria del haz Raman y se utilizan para bloquear selectivamente la línea láser (dispersión de Rayleigh) mientras permiten que la luz dispersada Raman pase al espectrómetro y al detector. Cada longitud de onda láser requiere un filtro individual. Existen dos tipos principales de filtros utilizados, ambos pueden emplearse sin intervención ni optimización del usuario:

• Edge. Un filtro de borde es un filtro óptico pasa largo que absorbe todas las longitudes de onda hasta cierto punto, y luego transmite con alta eficiencia todas las longitudes de onda superiores a ese punto. Por ejemplo, un filtro de borde de 532 nm absorberá toda la luz hasta 533,5 nm o más (por ejemplo, 50 ^cm-1 o más), incluyendo la emisión del láser. Por encima de 533,5 nm transmitirá luz, permitiendo la detección del espectro Raman (que va desde 50 ^cm-1 hasta 3500 ^cm-1 o más).  Los filtros de borde tienen un borde ultra pronunciado entre la región espectral absorbente y transmisora, y ofrecen un excelente bloqueo de la línea láser. La ventaja del filtro de borde es que es ambientalmente estable y tiene una vida útil casi infinita.

• Muesca holográfica. Un filtro de muesca tiene una absorción aguda y discreta que, para Raman, se elige para coincidir con una longitud de onda láser específica. Normalmente, la absorción será de unos pocos nanómetros de ancho (correspondiente a unos cientos ^{de cm-1}). Por ejemplo, para un láser de 532 nm, se elegirá un filtro de muesca con absorción central a 532 nm. La línea láser será absorbida, pero el espectro Raman anterior será transmitido. A diferencia del filtro de borde, la muesca tiene una vida útil finita y se degradará con el tiempo. La ventaja de la muesca es que permite realizar mediciones tanto para la dispersión Raman Stokes como para la anti-Stokes, lo cual es útil para ciertas mediciones especializadas.

• Espectrómetro de filtrado sintonizable con un instrumento monocromador triple, es posible trabajar en modo de 'espectrógrafo doble sustractivo, único'. Los dos primeros monocromadores se utilizan como un par entero, que primero dispersa tanto la luz dispersada por el Rayleigh (láser) como por la Raman, bloquea físicamente el Rayleigh y luego recombina la luz. El tercer espectrómetro actúa entonces de la manera normal para dispersar la luz dispersada Raman con la detección posterior. La ventaja de usar un espectrómetro triple de esta manera es que el filtro láser es infinitamente variable, y un instrumento puede usarse para trabajar con cualquier número de fuentes láser. Además, el rendimiento de filtrado es excelente y permite un análisis Raman de hasta 4-5 ^cm-1. Sin embargo, dicho instrumento requiere bastante más experiencia para funcionar en comparación con los sistemas monocromadores monocromadores basados en filtros más estándar, y por tanto rara vez se consideraría para análisis rutinarios.

Un CCD (Dispositivo Acoplado de Carga) es un detector multicanal basado en silicio que muestra luz UV, visible y infrarroja cercana. Se utilizan para espectroscopía Raman porque son extremadamente sensibles a la luz (y por tanto adecuados para el análisis de la señal Raman inherentemente débil) y permiten la operación multicanal (lo que significa que todo el espectro Raman puede detectarse en una sola adquisición). Los CCD se utilizan ampliamente, no solo como sensores en cámaras digitales, pero las versiones para espectroscopía científica son de calidad considerablemente superior para ofrecer la mejor sensibilidad, uniformidad y características de ruido posibles.

Los detectores CCD suelen ser matrices unidimensionales (lineales) o bidimensionales (de área) que agrupan miles o millones de elementos individuales del detector (también conocidos como píxeles). Cada elemento interactúa con la luz para acumular una carga: cuanto más brillante es la luz y/o cuanto más larga es la interacción, más carga se registra. Al final de la lectura de la medición, la electrónica extrae la carga de los elementos, momento en el que se mide cada lectura individual de carga.

En un espectrómetro Raman típico, la luz dispersada Raman se dispersa usando la rejilla de difracción, y esta luz dispersa se proyecta sobre el eje largo de la matriz CCD. El primer elemento detectará la luz desde el borde bajo ^cm-1 del espectro, el segundo elemento detectará la luz de la siguiente posición espectral, y así sucesivamente... El último elemento detectará la luz desde el borde alto ^cm-1 del espectro.

Los CCD requieren cierto grado de refrigeración para ser adecuados para espectroscopía de alta calidad. Normalmente esto se realiza mediante refrigeración peltier (adecuada para temperaturas de hasta -90ºC) y criogénica por nitrógeno líquido. La mayoría de los sistemas Raman utilizan detectores refrigerados por Peltier, pero para ciertas aplicaciones especializadas, los detectores refrigerados por nitrógeno líquido siguen teniendo ventajas.

Un CCD Multiplicador de Electrones (EMCCD) es un tipo especial de detector CCD, que utiliza la tecnología más avanzada para mejorar la calidad del espectro cuando hay niveles de señal extremadamente bajos. Esta mejora es especialmente valiosa cuando la señal Raman es muy débil, ya que el proceso de multiplicación de electrones puede dar lugar a una buena calidad espectral, a diferencia del CCD convencional, donde solo se pueden observar unas pocas de las características más fuertes por encima del ruido. Los beneficios de la ganancia EM son claramente evidentes en la imagen espectral Raman rápida, donde los tiempos de integración cortos necesarios a menudo pueden resultar en señales apenas visibles por encima del ruido cuando se miden con un CCD convencional.

El EMCCD tiene dos registros de lectura en el chip: un registro convencional y un registro de multiplicación de electrones (EM). En el registro electromagnético, las tensiones de reloj utilizadas son mayores que en el reloj convencional, lo que hace que los electrones adquieran suficiente energía como para que pueda producirse ionización por impacto. En este punto, se producen electrones extra y se almacenan en el siguiente píxel. Existe solo una pequeña probabilidad de que los electrones adquieran suficiente energía para que ocurra la ionización por impacto (creando así electrones adicionales), pero dado que el registro de lectura contiene muchos elementos, son posibles factores de ganancia significativos (hasta ~1000x). El principal beneficio de un EMCCD es que la amplificación ocurre antes de la lectura de la señal, lo que significa que la señal no está limitada por el ruido de lectura. En otras palabras, mediante amplificación, la señal se eleva muy por encima del nivel de ruido de fondo, que está determinado en gran medida por el ruido de la electrónica de lectura (preamplificador y convertidor A/D).

La resolución espectral es la capacidad de resolver características y bandas espectrales en sus componentes separados. La resolución espectral requerida por el analista o investigador depende de la aplicación involucrada. Por ejemplo, el análisis rutinario para la identificación básica de muestras suele requerir una resolución baja/media. En contraste, la caracterización de polimorfos y cristalinidad a menudo requiere alta resolución, ya que estos fenómenos solo muestran cambios muy sutiles en el espectro Raman, que no serían visibles en un experimento de baja resolución.

La resolución espectral es un parámetro experimental importante. Si la resolución es demasiado baja, se perderá información espectral, impidiendo la correcta identificación y caracterización de la muestra. Si la resolución es demasiado alta, el tiempo total de medición puede ser mayor de lo necesario. Lo que hace que la resolución sea "demasiado baja" o "demasiado alta" depende de la aplicación concreta y de la información deseada del experimento.

Normalmente, la resolución baja/media es adecuada para la identificación química básica y para distinguir diferentes materiales. Se vuelve necesaria una mayor resolución para caracterizar características espectrales más sutiles, por ejemplo, cambios menores en la forma o posición de un pico. Existen varios fenómenos químicos que causan estos cambios espectrales tan sutiles:

• Cristalinidad– En general, los picos Raman se vuelven más agudos e intensos a medida que un material pasa de una estructura amorfa a cristalina. La alta resolución espectral permite caracterizar incluso cambios muy pequeños en la cristalinidad.

• Polimorfismo: Los polimorfos son materiales que tienen la misma fórmula química pero diferentes formas en estado sólido. Debido a que la fórmula química es idéntica, sus perfiles espectrales Raman generales son similares, pero la influencia de la forma sólida en las vibraciones individuales de enlace provoca cambios sutiles en el espectro. Por tanto, no es sorprendente observar pequeños cambios en las formas y posiciones de los picos a lo largo del espectro.

• Esfuerzo/deformación intrínseca: Algunos materiales (especialmente los semiconductores) muestran cambios en sus espectros de Raman/fotoluminiscencia cuando se someten a esfuerzos y deformaciones. En el caso de los semiconductores, la tensión o deformación se induce cuidadosamente dentro del material para producir propiedades semiconductoras y/o luminiscentes necesarias para su uso en dispositivos de trabajo. Raman se utiliza como una herramienta vital para caracterizar la tensión o deformación, pero a menudo el efecto sobre el espectro es sutil; por lo tanto, es necesaria una alta resolución.

• Enlaces de hidrógeno: Las débiles interacciones inter- e intramoleculares causadas por los enlaces de hidrógeno pueden provocar pequeños cambios en un espectro Raman y, con alta resolución, el espectro puede utilizarse para investigar tales interacciones.

• Plegamiento de proteínas: La estructura primaria de una proteína, por supuesto, tendrá un impacto significativo en los espectros Raman resultantes, pero las estructuras secundarias y terciarias que comprenden plegamientos localizados y más extendidos causan una perturbación suficiente en los modos vibracionales como para afectar al espectro. Una vez más, el efecto será sutil y solo el análisis de alta resolución permitirá su caracterización.

La resolución espectral en un espectrómetro Raman dispersivo está determinada por cuatro factores principales. En las discusiones siguientes, el efecto de cada factor se considera bajo la suposición de que todos los demás factores permanecen sin cambios. En la vida real, todos estos factores pueden existir en muchas permutaciones variadas, lo que dificulta la comparación directa del rendimiento y las capacidades de un sistema.

Distancia focal del espectrómetro

Cuanto mayor sea la distancia focal (por ejemplo, la distancia entre la rejilla dispersora y el detector) del espectrómetro, mayor será la resolución espectral. Los espectrómetros Raman típicos tienen longitudes focales que van desde 200 mm (para baja o media resolución) hasta 800 mm o más (para alta resolución). A veces se olvida que un espectrómetro de larga distancia focal no se limita solo a trabajos de alta resolución: con una elección adecuada de rejillas (véase más abajo), un espectrómetro de alta resolución puede funcionar en modo de baja reso-lución. De este modo, es ideal para análisis de baja o media resolución para cribado rutinario, y sin embargo también puede ofrecer análisis de alta resolución para aplicaciones más especializadas.

Rejilla de difracción

Cuanto mayor sea la densidad de ranuras de la rejilla (normalmente medida como número de ranuras por milímetro), mayor será la resolución espectral. Las rejillas típicas utilizadas para Raman varían desde quizás 300 gr/mm (baja resolución) hasta 1800 gr/mm (alta resolución). También están disponibles rejillas más especializadas (incluyendo 2400 gr/mm y 3600 gr/mm), pero tienen ciertas limitaciones y no deben considerarse de uso general. El uso de redes de mayor densidad de ranura no puede aplicarse indefinidamente para aumentar la resolución espectral, ya que tendrán límites prácticos y físicos fijos vinculados al propio espectrómetro. Así, las redes proporcionan una forma inicial de mejorar la resolución, pero una vez alcanzado su límite, es necesario pasar a un espectrómetro focal más largo.

Longitud de onda láser

La potencia de dispersión de un par de rejilla/espectrómetro suele considerarse constante en términos de longitud de onda. Sin embargo, los espectros Raman utilizan una unidad relacionada con la energía (desplazamiento Raman, o número de onda, ^cm-1), lo que significa que la resolución espectral disminuye a medida que la excitación láser cambia de infrarrojo a visible y luego a longitudes de onda ultravioletas. Por ejemplo, si se utiliza una rejilla de 600 gr/mm con un láser infrarrojo, se requerirá una rejilla de 1200 gr/mm o 1800 gr/mm con un láser verde para lograr una resolución similar.

Detector

La mayoría de los sistemas tienen un único detector, por lo que prácticamente el usuario no tiene control sobre este factor. Sin embargo, hay que señalar que diferentes detectores pueden configurarse con distintos tamaños de píxeles. Cuanto más pequeño es el píxel, mayor es la resolución espectral alcanzable.

Un microscopio Raman combina un espectrómetro Raman con un microscopio óptico estándar. El haz láser de excitación se enfoca a través del microscopio para crear un micropunto con un diámetro del orden de 0,5-10 μm. La señal Raman de la muestra se recoge de una zona similar, pasa de nuevo por el microscopio al espectrómetro y allí se analiza para obtener información espectral.

El microscopio Raman permite realizar espectroscopía Raman con resolución espacial microscópica. Así, abre una nueva dimensión en el análisis químico:

• Análisis e identificación de partículas individuales con dimensiones de hasta 0,5 μm.
• Caracterización de características de muestra con dimensiones de hasta 0,5 μm.
• Localización e identificación de contaminantes microscópicos.
• Mapeo Raman (imagen) de las características de la muestra para mostrar la distribución de componentes, con una resolución espacial de hasta 0,5 μm.

Simplemente añadir un microscopio ayuda a obtener una resolución espacial lateral (XY), pero no proporciona resolución espacial de profundidad (Z). Para esto se requieren ópticas confocales. Hoy en día se utilizan varios métodos, algunos realmente confocales, otros pseudo-confocales, que funcionan con éxito variable. Para un diseño confocal verdadero (que incorpora una apertura estenopeica confocal totalmente ajustable) es posible una resolución de profundidad micrónica, permitiendo analizar discretamente capas individuales de una muestra.

Algunos microscopios Raman no disponen de óptica confocal. Simplemente añadir un microscopio ayuda a obtener una resolución espacial lateral (XY), pero no proporciona resolución espacial de profundidad (Z). Para ello, se requiere óptica confocal. Hoy en día se utilizan varios métodos, algunos realmente confocales, otros pseudo-confocales, que funcionan con éxito variable. Con un diseño confocal verdadero (que incorpora una apertura estenopeica confocal totalmente ajustable) es posible la resolución de profundidad micrónica, permitiendo analizar discretamente capas individuales de una muestra.