What is a Raman Instrument and How Does it Work?

Longitudes de onda láser que van desde ultravioleta hasta visible hasta infrarrojo cercano pueden utilizarse para espectroscopía Raman. Ejemplos típicos incluyen (pero no se limitan a):

• Ultravioleta: 244 nm, 266 nm, 320 nm, 355 nm, 405 nm
• Visible: 458 nm, 473 nm, 515 nm, 532 nm, 594 nm, 633 nm, 660 nm
• Infrarrojo cercano: 785 nm, 830 nm, 980 nm, 1064 nm

La elección de la longitud de onda del láser tiene un impacto importante en las capacidades experimentales:

Sensibilidad

La intensidad de dispersión Raman es proporcional a ^λ-4, donde λ es la longitud de onda del láser. Así, un láser infrarrojo provoca una disminución de la intensidad de dispersión por un factor de 15 o más, en comparación con los láseres visibles azul/verde.

Resolución espacial                   

El diámetro del punto láser limitado por difracción puede calcularse según la ecuación, diámetro = 1,22 λ/NA (donde λ es la longitud de onda del láser y NA es la apertura numérica del objetivo del microscopio utilizado). Por ejemplo, con un láser de 532 nm y un objetivo de 0,90/100x, el diámetro teórico del punto será de 0,72 μm; con el mismo objetivo, un láser de 785 nm produciría un diámetro teórico de punto de 1,1 μm. Por tanto, la resolución espacial alcanzable depende en parte de la elección del láser. 

Optimización del resultado basada en el comportamiento de la muestra

Por ejemplo:

• Los láseres azules o verdes pueden ser buenos para materiales inorgánicos y experimentos Raman de resonancia (por ejemplo, para nanotubos de carbono y otros materiales de carbono) y para la Dispersión Raman Mejorada en Superficie (SERS).
• El rojo o el infrarrojo cercano (660-830 nm) son buenos para la supresión de fluorescencia.
• Láseres ultravioleta para resonancia Raman en biomoléculas (como proteínas, ADN y ARN) y supresión de fluorescencia.

Los láseres ultravioleta (UV) para espectroscopía Raman suelen incluir longitudes de onda láser que van desde 244 nm hasta 355 nm.

Teóricamente, la espectroscopía Raman UV no difiere del análisis estándar que utiliza longitudes de onda láser visibles. Sin embargo, en la práctica existen varias dificultades y desventajas prácticas que deben considerarse.

Ventajas

• With certain samples, UV laser excitation can interact in ways not possible when using visible laser sources. For example, in semiconductor materials, the penetration depth of UV light is typically in the order of a few nanometers, and thus UV Raman can be used to selectively analyze from a thin top surface layer (as is commonly found in silicon on insulator SOI materials). In another example, UV excitation can give rise to specific resonance enhancement with biological moieties, particularly protein, DNA and RNA structures. Specific analysis of these materials within tissue can be difficult using visible laser wavelengths.
   
• La supresión de fluorescencia a menudo puede ser asistida mediante láseres UV, separando espectralmente las firmas Raman y fluorescente. Con los láseres visibles es común que se superpongan Raman y fluorescencia, y la intensidad incomparable de la fluorescencia es lo que puede perturbar (o enmascarar completamente) el espectro Raman. Con la excitación UV, el espectro Raman se encuentra cerca de la línea láser, mientras que la fluorescencia suele estar ligeramente desplazada a longitudes de onda superiores. Por tanto, ya no se solapan y la fluorescencia deja de ser un problema.
   
• Increased sensitivity can result from UV excitation, since Raman scattering efficiency is proportional to λ^-4 , where λ is the laser wavelength. Thus, Raman scattering at 325 nm is a factor of 14 times more efficient than that at 633 nm.

Desventajas

• El UV Raman sigue siendo una técnica más sofisticada que requiere mayor experiencia para manejarla. Las razones de esto incluyen el hecho de que el haz láser ahora es invisible, y que los láseres son más grandes, complejos y considerablemente más caros.
   
• Las muestras son más propensas a quemarse y degradarse por el haz láser, ya que aumenta la energía por fotón. Sin embargo, nuevas técnicas como la óptica DuoScan™ permiten que el haz láser se rastere rápidamente sobre la muestra y así evitar la quema inmediata. Por ejemplo, la celulosa arde con excitación de 325 nm en pocos milisegundos, pero con DuoScan™ sigue siendo resistente a la combustión durante más de cinco minutos.
   
• Many Raman systems designed for visible and near infra- red analysis are not suitable for UV Raman. UV Raman requires specific mirror coatings, microscope objectives, diffraction gratings, and a CCD detector for optimized results. Modern systems such as the LabRAM Odyssey can be configured to work efficiently from the UV through to the infra-red without compromise, but nonetheless the additional requirements do come at a cost.

Near infra-red (NIR) lasers for Raman typically include a range of wavelengths greater than 700 nm, such as 785 nm, 830 nm, 980 nm and 1064 nm. The key reason for the use of NIR Raman is for fluorescence suppression, but there are a number of drawbacks which must be considered. Whilst at times NIR Raman is invaluable, it should certainly not be considered the best solution for every sample.

Ventajas

• La supresión de fluorescencia a menudo puede ser asistida mediante láseres NIR. La fluorescencia es un proceso de dos fotones, que primero requiere la absorción de un fotón, seguida por la emisión de un fotón fluorescente. Por otro lado, Raman es un proceso de dispersión de un solo fotón, que no requiere absorción. Aunque muchos materiales absorben en la región visible, menos lo hacen en la región NIR. Así, en muchos casos los láseres NIR no generarán fluorescencia (ya que no se produce absorción), pero la dispersión Raman estará presente como es normal. En casos donde las muestras fluorescen fuertemente con excitación visible, el RAMAN NIR puede proporcionar una solución y permitir que aún se obtenga un buen espectro Raman.

Desventajas

• La disminución de la sensibilidad puede deberse a la excitación NIR, ya que la eficiencia de dispersión Raman es proporcional a ^λ-4, donde λ es la longitud de onda del láser. Así, la dispersión Raman a 785 nm es casi un factor 5 veces menos eficiente que a 532 nm. Este problema se agrava por la disminución de la sensibilidad del detector CCD en el rango de NIR Raman. Como resultado, los tiempos de medición suelen aumentarse considerablemente para obtener una calidad espectral similar a la de las mediciones realizadas con láseres visibles.
   
• Los láseres NIR suelen tener cualidades de haz (por ejemplo, ancho y divergencia del haz) que no son tan adecuadas para la microscopía. El resultado es que la resolución espacial puede verse algo comprometida y, por tanto, los resultados alcanzables pueden no cumplir con las predicciones teóricas.

Existen dos clases principales de filtros utilizados en espectroscopía Raman.

Filtros ópticos

These optical components are placed in the Raman beam path, and are used to selectively block the laser line (Rayleigh scatter) while allowing the Raman scattered light through to the spectrometer and detector. Each laser wavelength requires an individual filter. There are two main types of filters used, both of which can be used without user intervention or optimization:

• Edge. An edge filter is a long pass optical filter which absorbs all wavelengths up to a certain point, and then transmits with high efficiency all wavelengths above this point. As an example, a 532 nm edge filter will absorb all light up to 533.5 nm or above (e.g., 50 cm^-1 or above) including the laser emission. Above 533.5 nm it will transmit light, allowing detection of the Raman spectrum (stretching from 50 cm^-1 up to 3500 cm^-1 or  above). The edge filters have an ultra steep edge between the absorbing and transmitting spectral region, and offer excellent blocking of the laser line.The advantage of the edge filter is that it is environmentally stable with a near infinite lifetime.
   
• Holographic notch. A notch filter has a sharp, discrete absorption which for Raman is chosen to coincide with a specific laser wavelength. Typically the absorption will be a few nanometers wide (corresponding to a few hundred cm^-1). As an example, for a 532 nm laser, a notch filter will be chosen with a central absorption at 532 nm. The laser line will be absorbed, but the Raman spectrum above will be transmitted. Unlike the edge filter, the notch does have a finite lifetime, and will degrade with time. The advantage of the notch is that it allows measurements to be made for both the Stokes and anti-Stokes Raman scattering, which is useful for certain specialized measurements.
   
• Tunable filtering spectrometer with a triple monochromator instrument, it is possible to work in a ‘double subtractive, single spectrograph’ mode. The first two monochromators are used as an integral pair, which first disperses both the Rayleigh (laser) and Raman scattered light, physically blocks the Rayleigh, and then recombines the light. The third spectrometer then acts in the normal way to disperse the Raman scattered light with subsequent detection. The advantage of using a triple spectrometer in this way is that the laser filter is infinitely variable, and the one instrument can be used to work with any number of laser sources. In addition, the filtering performance is excellent, and allows Raman analysis down to 4-5 cm^-1. However, such an instrument does require rather more expertise to operate compared to the more standard filter based single monochromator systems, and therefore would rarely be considered for routine analysis.

Un CCD (Dispositivo Acoplado de Carga) es un detector multicanal basado en silicio que muestra luz UV, visible y infrarroja cercana. Se utilizan para espectroscopía Raman porque son extremadamente sensibles a la luz (y por tanto adecuados para el análisis de la señal Raman inherentemente débil) y permiten la operación multicanal (lo que significa que todo el espectro Raman puede detectarse en una sola adquisición). Los CCD se utilizan ampliamente, no solo como sensores en cámaras digitales, pero las versiones para espectroscopía científica son de calidad considerablemente superior para ofrecer la mejor sensibilidad, uniformidad y características de ruido posibles.

CCD detectors are typically one dimensional (linear) or two dimensional (area) arrays of thousands or millions of individual detector elements (also known as pixels). Each element interacts with light to build up a charge – the brighter the light, and/or the longer the interaction, the more charge is registered. At the end of the measurement read out, electronics pull the charge from the elements, at which point each individual charge reading is measured.

In a typical Raman spectrometer, the Raman scattered light is dispersed using the diffraction grating, and this dispersed light is then projected onto the long axis of the CCD array. The first element will detect light from the low cm^-1 edge of the spectrum, the second element will detect light from the next spectral position, and so on... the last element will detect light from the high cm^-1 edge of the spectrum.

Los CCD requieren cierto grado de refrigeración para ser adecuados para espectroscopía de alta calidad. Normalmente esto se realiza mediante refrigeración peltier (adecuada para temperaturas de hasta -90ºC) y criogénica por nitrógeno líquido. La mayoría de los sistemas Raman utilizan detectores refrigerados por Peltier, pero para ciertas aplicaciones especializadas, los detectores refrigerados por nitrógeno líquido siguen teniendo ventajas.

Un CCD Multiplicador de Electrones (EMCCD) es un tipo especial de detector CCD, que utiliza la tecnología más avanzada para mejorar la calidad del espectro cuando hay niveles de señal extremadamente bajos. Esta mejora es especialmente valiosa cuando la señal Raman es muy débil, ya que el proceso de multiplicación de electrones puede dar lugar a una buena calidad espectral, a diferencia del CCD convencional, donde solo se pueden observar unas pocas de las características más fuertes por encima del ruido. Los beneficios de la ganancia EM son claramente evidentes en la imagen espectral Raman rápida, donde los tiempos de integración cortos necesarios a menudo pueden resultar en señales apenas visibles por encima del ruido cuando se miden con un CCD convencional.

El EMCCD tiene dos registros de lectura en el chip: un registro convencional y un registro de multiplicación de electrones (EM). En el registro electromagnético, las tensiones de reloj utilizadas son mayores que en el reloj convencional, lo que hace que los electrones adquieran suficiente energía como para que pueda producirse ionización por impacto. En este punto, se producen electrones extra y se almacenan en el siguiente píxel. Existe solo una pequeña probabilidad de que los electrones adquieran suficiente energía para que ocurra la ionización por impacto (creando así electrones adicionales), pero dado que el registro de lectura contiene muchos elementos, son posibles factores de ganancia significativos (hasta ~1000x). El principal beneficio de un EMCCD es que la amplificación ocurre antes de la lectura de la señal, lo que significa que la señal no está limitada por el ruido de lectura. En otras palabras, mediante amplificación, la señal se eleva muy por encima del nivel de ruido de fondo, que está determinado en gran medida por el ruido de la electrónica de lectura (preamplificador y convertidor A/D).

La resolución espectral es la capacidad de resolver características y bandas espectrales en sus componentes separados. La resolución espectral requerida por el analista o investigador depende de la aplicación involucrada. Por ejemplo, el análisis rutinario para la identificación básica de muestras suele requerir una resolución baja/media. En contraste, la caracterización de polimorfos y cristalinidad a menudo requiere alta resolución, ya que estos fenómenos solo muestran cambios muy sutiles en el espectro Raman, que no serían visibles en un experimento de baja resolución.

La resolución espectral es un parámetro experimental importante. Si la resolución es demasiado baja, se perderá información espectral, impidiendo la correcta identificación y caracterización de la muestra. Si la resolución es demasiado alta, el tiempo total de medición puede ser mayor de lo necesario. Lo que hace que la resolución sea "demasiado baja" o "demasiado alta" depende de la aplicación concreta y de la información deseada del experimento.

Normalmente, la resolución baja/media es adecuada para la identificación química básica y para distinguir diferentes materiales. Se vuelve necesaria una mayor resolución para caracterizar características espectrales más sutiles, por ejemplo, cambios menores en la forma o posición de un pico. Existen varios fenómenos químicos que causan estos cambios espectrales tan sutiles:

• Cristalinidad– En general, los picos Raman se vuelven más agudos e intensos a medida que un material pasa de una estructura amorfa a cristalina. La alta resolución espectral permite caracterizar incluso cambios muy pequeños en la cristalinidad.
   
• Polimorfismo: Los polimorfos son materiales que tienen la misma fórmula química pero diferentes formas en estado sólido. Debido a que la fórmula química es idéntica, sus perfiles espectrales Raman generales son similares, pero la influencia de la forma sólida en las vibraciones individuales de enlace provoca cambios sutiles en el espectro. Por tanto, no es sorprendente observar pequeños cambios en las formas y posiciones de los picos a lo largo del espectro.
   
• Esfuerzo/deformación intrínseca: Algunos materiales (especialmente los semiconductores) muestran cambios en sus espectros de Raman/fotoluminiscencia cuando se someten a esfuerzos y deformaciones. En el caso de los semiconductores, la tensión o deformación se induce cuidadosamente dentro del material para producir propiedades semiconductoras y/o luminiscentes necesarias para su uso en dispositivos de trabajo. Raman se utiliza como una herramienta vital para caracterizar la tensión o deformación, pero a menudo el efecto sobre el espectro es sutil; por lo tanto, es necesaria una alta resolución.
   
• Enlaces de hidrógeno: Las débiles interacciones inter- e intramoleculares causadas por los enlaces de hidrógeno pueden provocar pequeños cambios en un espectro Raman y, con alta resolución, el espectro puede utilizarse para investigar tales interacciones.
   
• Plegamiento de proteínas: La estructura primaria de una proteína, por supuesto, tendrá un impacto significativo en los espectros Raman resultantes, pero las estructuras secundarias y terciarias que comprenden plegamientos localizados y más extendidos causan una perturbación suficiente en los modos vibracionales como para afectar al espectro. Una vez más, el efecto será sutil y solo el análisis de alta resolución permitirá su caracterización.

La resolución espectral en un espectrómetro Raman dispersivo está determinada por cuatro factores principales. En las discusiones siguientes, el efecto de cada factor se considera bajo la suposición de que todos los demás factores permanecen sin cambios. En la vida real, todos estos factores pueden existir en muchas permutaciones variadas, lo que dificulta la comparación directa del rendimiento y las capacidades de un sistema.

Distancia focal del espectrómetro

Cuanto mayor sea la distancia focal (por ejemplo, la distancia entre la rejilla dispersora y el detector) del espectrómetro, mayor será la resolución espectral. Los espectrómetros Raman típicos tienen longitudes focales que van desde 200 mm (para baja o media resolución) hasta 800 mm o más (para alta resolución). A veces se olvida que un espectrómetro de larga distancia focal no se limita solo a trabajos de alta resolución: con una elección adecuada de rejillas (véase más abajo), un espectrómetro de alta resolución puede funcionar en modo de baja reso-lución. De este modo, es ideal para análisis de baja o media resolución para cribado rutinario, y sin embargo también puede ofrecer análisis de alta resolución para aplicaciones más especializadas.

Rejilla de difracción

Cuanto mayor sea la densidad de ranuras de la rejilla (normalmente medida como número de ranuras por milímetro), mayor será la resolución espectral. Las rejillas típicas utilizadas para Raman varían desde quizás 300 gr/mm (baja resolución) hasta 1800 gr/mm (alta resolución). También están disponibles rejillas más especializadas (incluyendo 2400 gr/mm y 3600 gr/mm), pero tienen ciertas limitaciones y no deben considerarse de uso general. El uso de redes de mayor densidad de ranura no puede aplicarse indefinidamente para aumentar la resolución espectral, ya que tendrán límites prácticos y físicos fijos vinculados al propio espectrómetro. Así, las redes proporcionan una forma inicial de mejorar la resolución, pero una vez alcanzado su límite, es necesario pasar a un espectrómetro focal más largo.

Longitud de onda láser

La potencia de dispersión de un par de rejilla/espectrómetro suele considerarse constante en términos de longitud de onda. Sin embargo, los espectros Raman utilizan una unidad relacionada con la energía (desplazamiento Raman, o número de onda, ^cm-1), lo que significa que la resolución espectral disminuye a medida que la excitación láser cambia de infrarrojo a visible y luego a longitudes de onda ultravioletas. Por ejemplo, si se utiliza una rejilla de 600 gr/mm con un láser infrarrojo, se requerirá una rejilla de 1200 gr/mm o 1800 gr/mm con un láser verde para lograr una resolución similar.

Detector

La mayoría de los sistemas tienen un único detector, por lo que prácticamente el usuario no tiene control sobre este factor. Sin embargo, hay que señalar que diferentes detectores pueden configurarse con distintos tamaños de píxeles. Cuanto más pequeño es el píxel, mayor es la resolución espectral alcanzable.

A Raman microscope combines a Raman spectrometer with a standard optical microscope. The excitation laser beam is focused through the microscope to create a micro-spot with a diameter in the order of 0.5-10 µm. The Raman signal from the sample is collected from a similar area, passes back through the microscope into the spectrometer and is there analyzed for spectral information.

El microscopio Raman permite realizar espectroscopía Raman con resolución espacial microscópica. Así, abre una nueva dimensión en el análisis químico:

• Análisis e identificación de partículas individuales con dimensiones de hasta 0,5 μm.
• Caracterización de características de muestra con dimensiones de hasta 0,5 μm.
• Localización e identificación de contaminantes microscópicos.
• Mapeo Raman (imagen) de las características de la muestra para mostrar la distribución de componentes, con una resolución espacial de hasta 0,5 μm.
   

Simplemente añadir un microscopio ayuda a obtener una resolución espacial lateral (XY), pero no proporciona resolución espacial de profundidad (Z). Para esto se requieren ópticas confocales. Hoy en día se utilizan varios métodos, algunos realmente confocales, otros pseudo-confocales, que funcionan con éxito variable. Para un diseño confocal verdadero (que incorpora una apertura estenopeica confocal totalmente ajustable) es posible una resolución de profundidad micrónica, permitiendo analizar discretamente capas individuales de una muestra.

Algunos microscopios Raman no disponen de óptica confocal. Simplemente añadir un microscopio ayuda a obtener una resolución espacial lateral (XY), pero no proporciona resolución espacial de profundidad (Z). Para ello, se requiere óptica confocal. Hoy en día se utilizan varios métodos, algunos realmente confocales, otros pseudo-confocales, que funcionan con éxito variable. Con un diseño confocal verdadero (que incorpora una apertura estenopeica confocal totalmente ajustable) es posible la resolución de profundidad micrónica, permitiendo analizar discretamente capas individuales de una muestra.