Técnicas de Vida Útil de la Fluorescencia: TCSPC, TRASTES, TRES y SSTD

TCSPC significa conteo de fotones individuales correlacionados con el tiempo. Es un método que utiliza el tiempo de una fuente de excitación pulsada, como un láser o un LED, con el tiempo de llegada de fotones individuales a un detector para reconstruir la decaimiento a lo largo de la vida en muchos eventos (repetición de pulsos y fotones detectados). Esta técnica se basa en el hecho de que la probabilidad de detectar un solo fotón en el momento t, tras un pulso excitante, es proporcional a la intensidad de fluorescencia en el tiempo t.

La repetición de un láser o LED pulsado a una tasa de repetición relativamente alta (10 kHz a 100 MHz) se sincroniza con el momento en que el siguiente fotón llega a un detector (es decir, PMT). Se utiliza electrónica de temporización en forma de convertidor de tiempo a digital o convertidor de tiempo a amplitud (TAC) para registrar estos eventos en sucesión, hasta que se recopilan estadísticas suficientes para reconstruir la desintegración. La desintegración se ajusta entonces a una función exponencial para modelar la decaimiento a la duración de la vida (t). El TCSPC se utiliza típicamente para medir vidas útiles de fluorescencia desde la escala de picosegundos hasta microsegundos.

Utilizando el modo cinético TCSPC, se pueden realizar mediciones individuales en tan solo 1 ms y hasta 10.000 mediciones sin interrupciones. Mientras ocurra un cambio en la vida útil de la fluorescencia, este enfoque, en lugar de la intensidad, puede utilizarse para seguir un proceso cinético.

Obviamente, se necesita un número suficiente de fotones para poder analizar los datos. Esto puede mejorarse utilizando una tasa de repetición muy alta, pero es necesario tener en cuenta la vida útil y el rango de tiempo, para no volver a excitar la muestra antes de que se haya desintegrado por completo. Los datos de vida útil pueden entonces utilizarse para construir trazas cinéticas para el proceso.

Si puedes medir la fluorescencia, puedes medir FRET (Transferencia de Resonancia de Energía de Förster). El FRET es la interpretación del resultado de la medición, más que una técnica de medición. El FRET ocurre cuando la emisión de una molécula donante se solapa con la absorción de una molécula aceptor. Cuando ambos están lo suficientemente cerca, sufren una interacción dipolo-dipolo y se transfiere energía. La distancia a la que hay un 50% de energía transferida se denomina distancia de Förster y este valor se conoce típicamente para pares comunes de FRET. Midiendo el cambio de intensidad de fluorescencia o la vida útil de la molécula donante en presencia del aceptor, se puede determinar la eficiencia del FRET y, por tanto, la distancia entre ambos. El FRET puede medirse utilizando espectros de fluorescencia (intensidades) o vidas útiles de fluorescencia.

Se necesitan varias mediciones; ID, la intensidad (o t _D, la vida útil) medida en el pico de emisión del donante solo, I _DA, la intensidad (o t _DA, la duración de la vida) medida en el pico de emisión del donante en presencia de un aceptador, _{I A}, la intensidad (o t _A, la vida útil) medida en el pico de emisión del donante con la presencia de un aceptador pero no del donante y I _B, la intensidad (o t _B, la vida útil) medida en el pico de emisión del donante usando solución en blanco (es decir, solo tampón). A partir de estos, la eficiencia, E, puede utilizarse junto con la distancia de Förster (R ₀) para calcular R, la distancia entre las moléculas donante y aceptora que se miden. Consulta las ecuaciones en la figura anterior.

El temple se refiere a la reducción de la emisión de fluorescencia, es decir, un aumento en la tasa de desintegración no radiativa (knr). El temple puede dividirse en formas "estáticas" y "dinámicas". En ambos casos, la intensidad de emisión disminuye, pero solo en el temple dinámico hay un cambio en la vida útil de la fluorescencia. Nota: Si la cinética sigue la cinética de Stern-Volmer y se utiliza una vida media de vida útil, esto debe calcularse usando la intensidad media.

El efecto del fotoblanqueo aumentará el tiempo de ejecución de la medición, ya que reduce efectivamente el número de fluoróforos que emiten (es decir, actúa como una disminución en la concentración) y reduce la intensidad de emisión. La vida no se verá afectada.

La medición espectral de emisión resuelta en el tiempo es una técnica que mide la desintegración de fluorescencia en longitudes de onda incrementales a lo largo del espectro de emisión de una muestra. Se obtiene un gráfico 3D de intensidad frente a tiempo frente a longitud de onda. Observando este conjunto de datos 3D en la dirección de los espectros en diferentes momentos en lugar de decaer en distintas longitudes de onda, se puede medir el espectro de emisión resuelto en el tiempo. Si una muestra contiene múltiples emisores con espectros superpuestos pero diferentes duraciones de vida, los espectros individuales de estos componentes pueden separarse usando TRES.

Por ejemplo, el 2-naftol se ioniza para formar 2-naftolato en el estado excitado. (Koti, 2001). El espectro de emisión en estado estacionario muestra dos picos, lo que indica que ambas especies están presentes. Medir la vida útil en longitudes de onda incrementales a lo largo del espectro de emisión muestra tasas de decaimiento muy diferentes en cada pico de emisión. Ajustando las desintegraciones, se puede observar cómo cambian las vidas útiles y/o amplitudes de los componentes en diferentes longitudes de onda de emisión.

Para el 2-naftol, el pico de emisión del 2-naftol a 354 nm tiene una vida útil diferente a la del 2-naftolato, que tiene un pico de emisión alrededor de 414 nm. El modelo de 2 estados del 2-naftol ionizado y no ionizado se muestra claramente en el TRES. Dos constantes de tiempo representan los diferentes tiempos de decaimiento para el 2-naftol (dominante de 3,4 ns a 357 nm) y 2-naftolato (dominante de 9,4 ns a 414 nm). Los datos que se muestran a continuación se midieron en un FluoroMax-4 con electrónica FluoroHub TCSPC y una fuente de excitación NanoLED-280 que opera a 1 MHz.

Otro uso de TRES es la medición de constantes de tiempo de reorientación del disolvente. (Horng, 1995). Observando un solo fluoróforo y cómo cambia el espectro de emisión con el tiempo, se puede graficar la energía máxima en función del tiempo y ajustarse para obtener una constante temporal. El desplazamiento del espectro en este caso puede deberse a que las moléculas del disolvente reorientan sus momentos dipolares en respuesta a un momento dipolar de estado excitado del fluoróforo. Ajustando la energía máxima del espectro de emisión a lo largo del tiempo, se puede obtener la(s) constante(s) de tiempo de reorientación de las moléculas del disolvente. (Horng, 1995).

Sí. Hay un par de formas de hacerlo, dependiendo de la muestra. Se puede realizar una medición cinética de TCSPC para monitorizar la unión si la vida útil cambia durante el proceso de unión. También se puede emplear anisotropía resuelta en el tiempo, ya que la unión afectará al tiempo de correlación rotacional. Debido a que esto se debe al cambio en el tamaño efectivo de la molécula, el tiempo de correlación rotacional es proporcional al volumen efectivo de la molécula.

En un ejemplo, se utiliza un retardo después de que la lámpara ha destellado para medir el espectro de fosforescencia. Sin demora, se puede observar tanto la fluorescencia de corta duración del péptido en esta muestra como la fosforescencia de mayor duración del terbio.

Variando el retardo, se pueden detectar selectivamente especies con fosforescencia de mayor duración separada de la fluorescencia de fondo en la misma muestra.

La composición de los lantánidos en materiales vidriosos puede estudiarse utilizando desintegraciones de fosforescencia resueltas en el tiempo. Aquí hay datos del estudio del contenido de erbio en diferentes vasos utilizando este método. La vida útil del erbio puede variar según los distintos tipos de vidrio y los procesos utilizados para fabricarlo.

La técnica del vagón de carga, o promediado de vagón de carga, es un método para medir una fosforescencia o decaimiento de fluorescencia de larga duración integrando en ventanas de integración fijas a lo largo del tiempo de decaimiento de la señal.

Se produce un parpadeo de una fuente pulsada, como una lámpara de destello de xenón, y se establece un retardo tras el pulso (idealmente un momento en que el destello de la lámpara se completa). El detector mide repetidamente una ventana de integración para obtener un promedio estadístico de la intensidad en esa ventana tras el destello. Luego, la ventana de integración se mueve incrementalmente a través de la desintegración a tiempos de decaimiento más largos. De este modo, se produce una desintegración que puede ajustarse a una desintegración exponencial para obtener la vida útil por la inversa de la tasa de desintegración. La técnica del vagón puede ser muy lenta, especialmente con desintegraciones de larga duración y emisores débiles. Sin embargo, dependiendo del ancho del pulso de xenón, las vidas útiles entre 10 μs y segundos pueden resolverse de forma relativamente económica, utilizando una fuente de luz sintonizable.

SSTD significa digital transitorio de disparo único. La técnica SSTD utiliza una fuente de luz pulsada, ya sea un láser pulsado o una lámpara de destello de xenón, para adquirir toda una curva de decaimiento fosforescente a partir de cada destello de la fuente pulsada. Tras cada pulso, la desintegración se captura y digitaliza en tiempo real con un PMT y un digitalizador transitorio. Se puede lograr fácilmente un promedio rápido de señal, ya que se mide una decaída completa tras cada disparo. Los espectros resueltos en el tiempo pueden medirse fácilmente mediante la integración numérica de la señal de decaimiento dentro del rango de tiempo definido por el usuario y el escaneo de un monocromador. Esto permite discriminar espectros según la vida útil del estado excitado respectivo.

La emisión de fluorescencia ocurre en la escala temporal de picosegundos a nanosegundos, mientras que la fosforescencia medida con SSTD ocurre en la escala de microsegundos a segundos. Variando la posición temporal y el ancho de la puerta de emisión de señal, se pueden detectar selectivamente espectros de fluorescencia y fosforescencia, como atestiguan los espectros de fenarteno en la figura adjunta. Aquí, la emisión de fentreeno en un vidrio congelado se midió con un retraso temporal gradualmente incrementado de la compuerta de detección para disminuir la contribución de la fluorescencia.

Un ejemplo de aplicación de SSTD puede observarse en el caso de la fosforescencia a temperatura ambiente (RTP) del triptófano Nase T1. Aquí, la señal se extraía mediante la filtración de la abrumadora fluorescencia de triptófano, lo que habría sido extremadamente difícil de lograr usando una fuente de excitación continua. La desintegración fosforescencia de la emisión muy débil también se midió en el mismo instrumento utilizando la función Single Shot Transient Digitizer (SSTD) (HORIBA PTI QuantaMaster Series, 2017).

La técnica de vagón óptico estroboscópico también se conoce como técnica estroboscópica. Es una técnica pulsada en el dominio temporal que destella una fuente de luz pulsada y luego activa una PMT, barriendo un pulso de alta tensión de duración temporal muy corta a lo largo de la cadena dinanoda de la PMT. Posteriormente, estos destellos se repiten y, mediante el uso de un generador de puerta de retardo, la intensidad se mide en un momento diferente después del destello, para construir una curva de decaimiento. Este método utiliza entonces múltiples destellos y promedios para mejorar la señal a ruido de la desintegración.

La técnica de Strobe es una técnica analógica que es inherentemente menos sensible que el TCSPC y no disfruta de estadísticas de Poisson verdaderas como sí lo hace el TCSPC. Sin embargo, tiene la ventaja de proporcionar desintegraciones de aproximadamente 150 ps a segundos con fuentes de baja tasa de repetición como diodos láser, LEDs, OPO sintonizable con Q-switched o láseres de nitrógeno/tinte. La técnica Strobe puede medir n espectros resueltos en el tiempo directamente fijando la posición de la puerta de retardo y escaneando el monocromador de emisión.

Una de las ventajas del Strobe es que puede recoger decaimiento tanto en escalas lineales como no lineales (es decir, progresión aritmética y logarítmica). Este último ayuda enormemente a resolver decaimientos multiexponenciales, donde las vidas pueden variar en órdenes de magnitud. Otra ventaja de la técnica estroboscópica es que puede funcionar con láseres sintonizables de baja tasa de repetición, como Q-switched/OPO o nitrógeno/tinte, que no pueden usarse con TCSPC. También puede funcionar con LEDs y diodos láser que operan hasta unos 25 kHz.

Un ejemplo de vida útil medida con estroboscópico es el análisis de desintegración y distribución durante la vida de las diapositivas de ZnO, como se muestra en la siguiente figura.

La conversión de fluorescencia hacia arriba es un proceso de 2 fotones, donde una muestra es excitada por dos fotones contemporáneos que llegan simultáneamente a la región de longitud de onda del infrarrojo cercano y la fluorescencia se emite a mayor energía (longitud de onda más baja) en la región visible del espectro.

Aunque la potencia de excitación necesaria dependerá de la muestra en cuestión, la conversión hacia arriba suele requerir una fuente de excitación de flujo de fotones más alta, como un láser. Por ello, las fuentes estándar de TCSPC pueden no tener el flujo necesario para realizar mediciones de conversión ascendente. Los láseres que emiten 980 nm pueden montarse directamente en un compartimento de muestra para excitar muestras directamente y medir espectros de conversión ascendente, vidas útiles o incluso rendimientos cuánticos. Los láseres OPO con conmutación Q y salida NIR eficiente también pueden usarse para la medición de la conversión ascendente de fluorescencia.

Las moléculas que absorben luz en la NIR y que pueden detectarse o incluso visualizarse en el rango visible son útiles. Esto se debe a que las fuentes de excitación UV de alta energía tienden a blanquear o causar daños fotoeléctricos en muestras biológicas. Las fuentes de NIR son excitantes a baja energía y normalmente no presentan este problema. Las moléculas que presentan conversión ascendente de fluorescencia incluyen lantánidos, nanopartículas semiconductoras y puntos cuánticos. El mismo láser DPSS de 980nm puede ser pulsado por pulsos TTL y utilizado para las mediciones de vida útil de conversión ascendente de PL, ya sea con la función MCS de la placa TCSPC o con la técnica SSTD.

Aunque la fluorescencia (y la fosforescencia) tiene una amplia gama de aplicaciones, hay dos áreas principales de investigación en las que el uso de este fenómeno destaca:

• Ciencias de la vida
• Ciencia de materiales

En cualquier aplicación donde se encuentre fluorescencia en estado estacionario, puede ser ventajoso emplear métodos de por vida para obtener información. Algunas de estas aplicaciones y técnicas de fluorescencia que pueden emplearse en su estudio se ilustran a continuación.

Ciencias biológicas

Ciencias de los Materiales