¿Qué es la anisotropía de fluorescencia o polarización de fluorescencia?

La anisotropía de fluorescencia o polarización de fluorescencia es una medida de la orientación cambiante de una molécula en el espacio, respecto al tiempo entre los eventos de absorción y emisión. La absorción y la emisión indican la alineación espacial de los dipolos de la molécula en relación con el vector eléctrico de la onda electromagnética de excitación y la luz emitida, respectivamente. En otras palabras, si la población de fluoróforos se excita con luz polarizada verticalmente, la luz emitida retendrá parte de esa polarización según la velocidad a la que gira en solución. Cuanto más rápido sea el movimiento de orientación, más despolarizada estará la luz emitida. Cuanto más lento es el movimiento, más la luz emitida mantiene la polarización.

Para utilizar esta información, los polarizadores se colocan en la trayectoria de la luz de excitación y la trayectoria de luz de emisión de un fluorómetro. La anisotropía se calcula tomando la relación de las intensidades en la ecuación anterior, donde la VIV indica la intensidad con excitación polarizada verticalmente y polarización vertical sobre la emisión detectada. La IVH indica la intensidad cuando se utiliza un polarizador vertical en la excitación y un polarizador horizontal en la emisión. G es un factor de rejilla utilizado como corrección para la transmisión diferencial de las dos orientaciones vectoriales ortogonales del instrumento.

¿Cómo funciona el experimento? Primero, la fluorescencia se mide con el polarizador de excitación en vertical y el polarizador de emisión también en orientación vertical. La intensidad se inserta en la ecuación de anisotropía como IVV. Luego, la medición se repite con el polarizador de emisión ajustado en orientación horizontal y la intensidad para se introduce en la ecuación como IVH.

La fórmula de anisotropía contiene un factor de 2 porque hay dos orientaciones ortogonales sobre las que la deflexión del vector VVz puede proyectarse, Hx y Hy, resultando en dos componentes IVH.

Una expresión relacionada, grado de polarización p, se utiliza a menudo para describir un parámetro de polarización bidimensional con solo un componente horizontal contabilizado. En este último caso, la fórmula carecería del multiplicador 2 para IVH, siendo p el lugar de r.

A continuación, el factor G se calcula midiendo la intensidad en HH y HV... y insertar IHV e IHH en la ecuación para G. La anisotropía, denotada con "r" minúscula, se utiliza a menudo como indicador de tamaño molecular, difusión y viscosidad.

Aquí tienes algunas ecuaciones útiles para analizar los resultados de anisotropía. La ecuación básica de anisotropía ya se ha discutido, pero la misma puede calcularse para desintegraciones completas de fluorescencia, dando lugar a anisotropía resuelta en el tiempo. A partir de la anisotropía resuelta en el tiempo, se pueden obtener constantes de tiempo de reorientación y luego usar la ecuación de Perrin y la ecuación de Stokes-Einstein-Debye para estimar propiedades como el coeficiente de difusión, la viscosidad local y los volúmenes moleculares.

Estas corresponden a información muy importante al analizar aplicaciones como la unión de proteínas o moleculares, la agregación de polímeros y otros estudios del entorno local en soluciones y materiales complejos.

Como ejemplo, se puede ver claramente el comportamiento de despliegue de proteínas dependiente de la temperatura de la BSA medido por anisotropía de fluorescencia. En este caso se utiliza la anisotropía de los residuos intrínsecos de triptófano.

La cinética de fluorescencia se refiere a la observación de la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo. Aquí, una muestra se excita en una sola longitud de onda y la emisión se detecta en una sola longitud de onda a lo largo del tiempo. A veces, se utilizan pares de longitudes de onda para colorantes ratiométricos o para registrar simultáneamente información de referencia o de fondo.

Las velocidades de reacción pueden seguirse mediante mediciones basadas en el tiempo, como puedes ver aquí. En este ejemplo, las tasas de reacción de la unión de tiamina y mercurio para formar tiacromo se determinan variando la concentración de tiamina utilizada. Cada barrido cinético representa una tasa de reacción diferente de la reacción de formación de tiacromo.

La cinética de fluorescencia se mide a menudo usando un accesorio de mezcla rápida llamado flujo detenido. El flujo detenido mezcla dos o más soluciones en el orden de unos pocos milisegundos para que la unión o reacción pueda registrarse más cerca del tiempo cero, sin los efectos de difusión.

Aquí se muestra la unión de un fluoróforo llamado SNA a una proteína, BSA. La fluorescencia del SNA aumenta al unirse, por lo que la velocidad de unión puede medirse usando cinética de fluorescencia. En este ejemplo, la unión del SNA a la BSA ocurre con una frecuencia de aproximadamente 400 milisegundos.

Los baños circulantes y los controladores de temperatura Peltier son dos accesorios que controlan la temperatura de una muestra en un fluorómetro. Los portacubetas "estándar" en sistemas fluorómetros tienen dos conexiones para permitir la circulación de líquidos, que pueden conectarse a un baño maría recirculante. Esto permite regular temperaturas en el rango de -40°C a 70°C.

Un método alternativo es usar un soporte de celda controlado por Peltier, que responde más rápido que un baño de agua y permite regular temperaturas en el rango de -25°C a 105°C. La diferencia es que un dispositivo Peltier controla la temperatura con mucha más precisión que un lote en circulación, que tiende a subir hasta alcanzar una temperatura, pasarla y volver hasta alcanzarla.

Los baños circulantes son buenos si hay que ajustar y mantener una temperatura durante un experimento, pero para medir muestras a diferentes temperaturas en un rango, o para muestras muy sensibles a los cambios de temperatura, un controlador de temperatura Peltier es una opción más práctica. También es posible utilizar criostatos y kits de montaje disponibles para diferentes modelos de criostatos de nitrógeno líquido y helio. Además de enfriar, la mayoría de los crióstatos también pueden calentar muestras hasta 500K o más.