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Cómo calcular la relación señal-ruido
Determinación de la relación señal-ruido de un espectrofluorómetro: Métodos y fórmulas para garantizar comparaciones precisas de sensibilidad
La fluorescencia es una técnica analítica altamente sensible, por lo que una de las principales especificaciones a considerar al seleccionar un espectrofluorómetro es su sensibilidad. La sensibilidad general de un espectrofluorómetro está determinada por muchos factores, incluyendo, pero no limitado a, el diseño óptico, la óptica de acoplamiento, la intensidad de la luz de excitación entregada, la eficiencia en la recolección de fluorescencia, el diseño del espectrómetro, la tecnología del detector y mucho más. Por ejemplo, un sistema con una lámpara de mayor potencia no garantiza que ofrezca una mejor sensibilidad general a la fluorescencia.
Dado que hay tantas variables en la fabricación de un fluorómetro sensible, lo que se necesita es una prueba de referencia estándar que cualquier usuario pueda realizar para comparar correctamente un fluorómetro con otro.
En el pasado, algunos fabricantes comerciales de fluorómetros utilizaban límites de detección para moléculas fluorescentes específicas, como sulfato de quinina o fluoresceína, para demostrar su sensibilidad. Sin embargo, hoy en día, los fluorómetros de mayor sensibilidad son capaces de detectar a concentraciones tan bajas de fluoróforos, que la capacidad para realizar una dilución en serie con precisión hasta estos límites de detección se vuelve cuestionable. Por ello, la prueba de agua Raman se ha convertido en un estándar de la industria como una buena medida de la sensibilidad relativa entre diferentes instrumentos. La prueba Raman de agua también es preferible porque el agua ultrapura está fácilmente disponible en todo el mundo, la muestra es estable, la señal es relativamente débil y la banda Raman del agua puede medirse en todo el rango de longitudes de onda del instrumento, lo que permite comparaciones más robustas que las posibles con una sola sonda fluorescente. Esta especificación de sensibilidad se deriva de un espectro de emisión de la banda vibracional Raman para agua pura. Normalmente se adquiere con la longitud de onda de excitación seleccionada en 350 nm, con un escaneo de emisión de 365 a 450 nm. En general, la sensibilidad del fluorómetro se expresa en una relación señal-ruido (SNR), que es una comparación de un valor de señal en presencia de una señal, con un valor para el ruido del sistema, en ausencia de señal.
Desafortunadamente, no todos los fabricantes utilizan las mismas condiciones experimentales para adquirir este conjunto de datos, y tampoco emplean las mismas fórmulas para calcular la SNR de los datos adquiridos. No existe una forma correcta o incorrecta de recopilar o analizar datos, pero está claro que diferentes métodos y análisis pueden dar cifras bastante distintas. Por lo tanto, es importante no solo saber cómo se adquirió el espectro Raman de agua, sino también cómo se trataron los datos. Si puedes asegurarte de que los datos se adquieren y analizan de la misma manera, puedes estar seguro de hacer una comparación justa entre dos fluorómetros diferentes.
En esta nota técnica señalamos los diferentes factores que influyen en la relación señal-ruido y articulamos el método HORIBA para permitir que los investigadores dispongan de las herramientas necesarias para realizar una comparación adecuada.
Durante décadas, HORIBA ha definido la SNR como la diferencia entre la señal de pico y la señal de fondo, dividida por la raíz cuadrada de la señal de fondo. A esto lo llamamos el método FSD (Primera desviación estándar).
También se le conoce como método de raíz cuadrada (SQRT).
La fórmula de la relación señal-ruido del FSD se muestra a continuación.
La señal máxima se mide en la intensidad máxima Raman del agua a 397 nm (para excitación de 350 nm) y el ruido en una región donde no hay señal Raman presente (450 nm). Para un sistema óptico perfecto no habría señal a 450 nm ya que no hay emisión Raman allí, sin embargo, todos los sistemas electro-ópticos tienen ciertos niveles de luz parásita y ruido, que contribuirán a una señal a 450 nm. La fórmula anterior asume que el ruido está gobernado por estadísticas de Poisson y, por tanto, puede calcularse como la raíz cuadrada del recuento de señales base en 450 nm. Solo es aplicable a la detección por conteo de fotones, por lo que para fines de comparación solo debe usarse al comparar dos espectrofluorómetros de conteo de fotones.
Otro método comúnmente utilizado es dividir la diferencia entre señal de pico y señal de fondo por el valor de Raíz Cuadrática Media (RMS) del ruido en la señal de fondo. Este segundo método es utilizado por varios fabricantes y es el mejor enfoque para espectrofluorómetros que emplean detectores analógicos, donde las unidades de intensidad varían de un fabricante a otro.
La fórmula de la relación señal-ruido RMS se muestra a continuación.
Para medir correctamente el valor de ruido RMS para el denominador, se realiza un segundo experimento en el que el fluorómetro se excita a 350 nm y la cinética se mide en función del tiempo a 450 nm de emisión.
La fórmula RMS viene dada por,
Donde la señal de fondo basada en el tiempo se mide n veces y S es el valor medio de intensidad a lo largo del escaneo cinético.
No todas las empresas usan la fórmula RMS mencionada arriba. Algunos usan el ruido pico a pico de los datos fuera de pico, por ejemplo de 420 a 450 nm, y otros más usan una estimación RMS, ya sea desde la parte fuera de pico del espectro o de un escaneo cinético secundario del pico. Al final, el método para determinar el ruido RMS no es tan crítico como aplicar la misma fórmula exacta a cualquier comparación que se haga.
En conclusión, no existe una mejor manera de calcular la relación de ruido de señal para la banda Raman del agua, y diferentes empresas lo hacen de distintas maneras. El método FSD es válido solo para comparar espectrofluorómetros de conteo de fotones. Al comparar uno o varios sistemas que usan detección analógica, entonces debe utilizarse RMS, o algún método de estimación RMS.
Mientras los diferentes conjuntos de datos calculen la sensibilidad de la misma manera, cualquier método particular proporcionará una medida relativa de la SNR de un espectro en comparación con otro.
Así como la fórmula utilizada para calcular la relación señal-ruido puede tener un efecto dramático en la aparente sensibilidad de cualquier conjunto de datos espectral en particular, la configuración hardware del instrumento y los parámetros experimentales de adquisición de datos también tienen un efecto dramático en la calidad del espectro adquirido.
Existen muchos parámetros de hardware, ajustes y opciones que afectan a la sensibilidad medida de un espectrofluorómetro. Esto puede dificultar mucho comparar absolutamente la sensibilidad relativa de dos instrumentos diferentes si no se utilizan de forma prácticamente idéntica. A continuación analizamos cada uno de estos factores y el impacto que tienen en los datos resultantes.
Longitud de onda de excitación: La longitud de onda de excitación debería ser idéntica para todos los sistemas que se comparen. El método HORIBA utiliza excitación de 350 nm para la banda Raman de agua, como hacen la mayoría de los fabricantes. Cuando se excita a 350 nm, la banda de emisión Raman para el agua alcanza un pico en 397 nm.
Es afortunado que la mayoría de los fabricantes hayan estandarizado esta longitud de onda de excitación, ya que permite una mejor comparación. Sin embargo, es perfectamente válido mover la longitud de onda de excitación a cualquier otro valor como forma de probar la sensibilidad en un rango diferente de longitudes de onda (por ejemplo, la NIR).
Rango de escaneo de emisiones: El método HORIBA escanea el monocromador de emisión de 365 a 450 nm, con incrementos de 0,5 nm, para recoger todo el pico Raman a 397 nm y también el fondo a 450 nm.
Ancho de banda (tamaño de la rendija): El método HORIBA utiliza rendijas paso de banda de 5 nm tanto en el espectrómetro de excitación como en el espectrómetro de emisión. Algunos fabricantes especifican rendijas de 10 nm, lo que tiene el efecto de aumentar la sensibilidad en comparación con las de 5 nm. Se ha informado que duplicar el tamaño físico de la rendija en la entrada y salida de un monocromador puede cuadruplicar la intensidad de la excitación y el rendimiento de detección de emisiones, ya que el rendimiento aumenta conforme aumenta el cuadrado del tamaño, pero esta es una estimación simplista que debería medirse empíricamente. HORIBA ha medido la diferencia de factores con el HORIBA Fluoromax y ha observado que para Fluoromax, duplicar el tamaño de las rendijas de 5 a 10 nm aumenta la relación señal-ruido global para la banda Raman del agua en más de 3 veces. Sin embargo, esto será diferente para cada fluorómetro, así que por favor asegúrate de no comparar con pasabandas idénticas.
Tiempo de integración (o tiempo de respuesta): Esto se refiere a cuánto tiempo se permite al detector para recoger una señal en una posición dada de paso de longitud de onda. También desempeña un papel importante en la sensibilidad general medida en un fluorómetro. El método HORIBA utiliza un tiempo de integración de 1 segundo en cada punto de longitud de onda, similar a otros fabricantes. Sin embargo, algunos fabricantes especifican un tiempo de respuesta de 2 segundos, lo que aumenta la relación señal-ruido en casi un factor de dos. Asegúrate de usar el mismo tiempo de integración (respuesta) al comparar.
Tipo PMT: La mayoría de los espectrofluorómetros utilizan un tubo fotomultiplicador (PMT) como único detector de emisión de fluorescencia, sin opción de cambiar la carcasa del detector. Esto es cierto para la mayoría de los fluorómetros analíticos de laboratorio. Algunos de estos sistemas de banco permiten seleccionar diferentes PMT individuales con distintos rangos de longitud de onda y especificaciones. Las PMT que no detectan tan profundamente en la NIR como otras PMT tendrán un recuento de oscuridad más bajo, por lo que proporcionarán una mejor relación señal-ruido en el rango de 350 a 400 nm, aunque pueden no ser utilizables en todo el rango de longitudes de onda de emisión deseadas para un laboratorio en particular. El PMT estándar de HORIBA utilizado en las series de fluorómetros FluoroMax Plus, Fluorolog3 y QuantaMaster 8000 es el PMT Hamamatsu R928P, considerado el estándar industrial para fluorometría. En estos casos, asegúrate de que cada fluorómetro utiliza el mismo PMT, siempre que sea posible.
Filtros ópticos: Se puede añadir un filtro óptico al camino óptico de un fluorómetro, ya sea en el lado de excitación o en el lado de emisión de la muestra. Estos pueden colocarse manualmente en un portafiltro dentro del compartimento de la muestra, o pueden formar parte de una rueda de filtros que puede colocar automáticamente diferentes filtros en el camino óptico cuando se seleccionan distintos protocolos experimentales. Los filtros ópticos tienen el efecto de mejorar el rechazo de la luz parásita en longitudes de onda dadas, y pueden mejorar drásticamente la relación señal-ruido de un fluorómetro. HORIBA no utiliza ningún filtro óptico, aparte de los propios espectrómetros de barrido, al especificar la SNR para Raman de agua con las especificaciones de las series Fluoromax, Fluorolog3 o QuantaMaster 8000. Al comparar un fluorómetro HORIBA con uno que utiliza filtros automáticos, por favor no utilice un filtro, o si es automático, confirme qué marca y tipo de filtros se emplean, y dónde se emplean, para replicar un método experimental similar con un fluorómetro HORIBA.
Tipo de detector: Los fluorómetros modulares de investigación suelen incluir una carcasa PMT como estándar, pero permiten muchos tipos diferentes de detectores de canal único para extender el rango de longitudes de onda, o la vida útil de fluorescencia de un instrumento. Detectores alternativos incluyen carcasas de PMT refrigeradas, varios detectores de estado sólido como InGaAs, PMT MCP, etc. Estos diferentes tipos de detectores tendrán efectos dramáticos en la relación señal-ruido de cualquier medición de muestra concreta, así que, de nuevo, al intentar comparar la sensibilidad de un fluorómetro con otro, asegúrate de que se utilice el mismo tipo de detector para recopilar datos en ambos sistemas.
Temperatura del detector: La mayoría de los espectrofluorómetros comerciales utilizan carcasas PMT que no están refrigeradas, y de hecho muchos instrumentos ni siquiera ofrecen una opción de detector refrigerado. Una carcasa PMT refrigerada puede mejorar la sensibilidad de un instrumento al reducir los recuentos oscuros (fondo) en comparación con la misma PMT exacta en una carcasa ambiental. Las carcasas estándar PMT de HORIBA en los modelos FluoroMaxPlus, Fluorolog3 y QuantaMaster 8000 son carcasas ambientales para PMT, sin embargo, las series Fluorolog3 y QuantaMaster 8000 ofrecen carcasas PMT refrigeradas opcionales para mejorar la sensibilidad y la detección de NIR. Al comparar fluorómetros modulares de investigación, asegúrate de comparar los datos recogidos con el mismo tipo de carcasa PMT (ambiente o refrigerada), y si están enfriados, también se enfrían a la misma temperatura.
Monocromador simple frente a doble: Los fluorómetros modulares de investigación permiten seleccionar monocromadores simples o dobles en la trayectoria óptica de excitación o emisión. Aquí, el término doble monocromador se refiere a dos etapas de rejilla dispersiva, una tras otra, con una rendija de entrada, una ranura intermedia y una ranura de salida. Un monocromador doble puede configurarse tanto en modo aditivo como dispersivo, pero en ambos casos el rendimiento y las características de luz dispersa de un monocromador simple frente a uno doble son muy diferentes y tendrán un gran impacto en la SNR de un escaneo Raman de agua, incluso si los anchos de banda, los tiempos de integración y las longitudes de onda se mantienen constantes.
Densidad de ranuras de la rejilla: La densidad de ranura de una red también afectará al rendimiento y, por tanto, a la sensibilidad de un espectrofluorómetro. Para la mayoría de los espectrofluorómetros esto no es un gran problema porque los sistemas se fabrican con una sola rejilla en particular. En este caso, lo más importante es asegurarse de que los pasaportes de banda sean los mismos. Sin embargo, para fluorómetros modulares, puedes configurar los monocromadores con diferentes rejillas o múltiples rejillas. Para estos sistemas, debes tener mucho cuidado de mantener las cosas lo más similares posible. Por ejemplo, cuando tienes dos instrumentos con espectrómetros de distancia focal similar, cambiar la densidad de ranura de la rejilla aumentará o disminuirá la sensibilidad para el mismo ajuste de paso de banda de 5 nm. El método HORIBA utiliza rejillas con una densidad de ranura de 1.200 ranuras por milímetro.
Ángulo de la rejilla de la llama: Las redes seleccionadas para un monocromador de excitación o emisión proporcionan un rendimiento óptimo en una banda de longitud de onda particular, conocida como ángulo de llama, ya que esto está determinado por el ángulo de grabado de la rejilla impartido sobre la superficie de la red. Por ello, un monocromador de excitación con un monocromador de excitación de 350 nm y un monocromador de emisión de 400 nm serían las opciones óptimas para lograr la mejor sensibilidad Raman al agua al excitarse a 350 nm. Como la mayoría de los fluorómetros no permiten ajustar la rejilla, esta variable no es un factor, pero para quienes sí permiten elegir rejillas, asegúrate de elegir rejillas con el mismo ángulo de marcado o muy similar para hacer una comparación válida.
Las condiciones experimentales para el escaneo de emisión Raman en agua ultrapura fueron las siguientes.
Espectrofluorómetro QuantaMaster QM-8075-11 (lámpara de xenón de 75 vatios, monocromador de excitación simple y emisión simple) con carcasa PMT refrigerada opcional.
Los resultados experimentales se encuentran a continuación.
Cabe señalar que este resultado en particular supera la especificación HORIBA mínima de agua Raman FSD para el espectrofluorómetro QM-8075-11 cuando está equipado con un PMT refrigerado R928 opcional, que actualmente se especifica en > 30.000:1 (Método FSD).
Resultados del FSD de agua Raman
Aunque debe prestarse cuidado para garantizar que las condiciones experimentales y las fórmulas matemáticas se apliquen de forma consistente, la relación señal-ruido del agua Raman es un buen determinante de la sensibilidad relativa de un fluorómetro en comparación con otro.
Al comparar espectrofluorómetros de conteo de fotones se prefiere el método FSD (SQRT).
HORIBA cuenta con una tradición de décadas de excelencia en la fabricación de fluorescencia, y estamos encantados de demostrar exactamente las condiciones en las que alcanzamos nuestras especificaciones de sensibilidad líderes en la industria.
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